Detta protokoll beskriver hur man etablerar, underhåller, genetiskt modifierar, differentierar, funktionellt karakteriserar och transplanterar tårkörtelorganoider härrörande från primär mus- och humanvävnad.
Lacrimalkörteln är ett viktigt organ för okulär ythomeostas. Genom att producera den vattenhaltiga delen av tårfilmen skyddar den ögat från uttorkningsstress och yttre förolämpningar. Lite är känt om tårkörtelns (pato)fysiologi på grund av bristen på adekvata in vitro-modeller . Organoidteknik har visat sig vara en användbar experimentell plattform för flera organ. Här delar vi ett protokoll för att upprätta och underhålla mus- och humana lacrimal körtelorganoider från lacrimal körtelbiopsier. Genom att modifiera odlingsförhållandena förbättrar vi tårkörtelorganoidfunktionaliteten. Organoid funktionalitet kan undersökas genom en “gråt” analys, vilket innebär att lacrimal körtelorganoider exponeras för utvalda neurotransmittorer för att utlösa tårfrisättning i deras lumen. Vi förklarar hur man avbildar och kvantifierar detta fenomen. För att undersöka rollen av gener av intresse för tårkörtelhomeostas kan dessa modifieras genetiskt. Vi beskriver grundligt hur man genetiskt modifierar tårkörtelorganoider med hjälp av basredigerare – från guide RNA-design till organoid klongenotypning. Slutligen visar vi hur man undersöker den regenerativa potentialen hos humana lacrimal körtelorganoider genom ortotopisk implantation i musen. Tillsammans ger denna omfattande verktygssats resurser för att använda mus- och humana tårkörtelorganoider för att studera tårkörtelfysiologi.
Lacrimalkörteln är det glandulära epitelet som är ansvarigt för att producera det mesta av det vattenhaltiga skiktet i tårfilmen1. Tårfilmens vattenhaltiga skikt innehåller inte bara vatten för att smörja ögonytan utan också en stor repertoar av antimikrobiella komponenter som skyddar ögonytan från infektioner2. När tårkörteln är skadad eller inflammerad uppstår torr ögonsjukdom, vilket resulterar i obehag för patienter och kan så småningom leda till synförlust3. Under årens lopp har modellsystem för att studera tårkörteln, särskilt den mänskliga körteln, begränsats 4,5,6. Detta har bidragit till en kunskapslucka om tårkörtelns funktion under fysiologiska och patologiska tillstånd.
Nyligen har in vitro-modeller utvecklats för att studera tårkörteln i en maträtt 7,8,9. Dessa tårkörtelorganoider härrör från vuxna stamceller odlade som tredimensionella strukturer i en extracellulär matris kompletterad med en cocktail av tillväxtfaktorer som upprätthåller deras regenerativa kapacitet in vitro7. Fördelen med vuxna stamceller (ASC)-härledda organoider är att de kan bibehållas under mycket lång tid samtidigt som friska vävnadsegenskaper rekapituleras. Denna typ av organoid består enbart av epitelceller, till skillnad från inducerade pluripotenta stamceller (iPSC)-härledda organoider, som också kan innehålla stromaceller, till exempel. Till skillnad från pluripotenta stamcellsbaserade organoider etableras ASC-organoider direkt från vuxen vävnad och kräver inga genetiska modifieringar för att expanderas. ASC-organoider uttrycker vuxna egenskaper10.
Detta protokoll innehåller en verktygslåda för att härleda tårkörtelorganoider från mus och mänsklig primärvävnad. Protokollet beskriver hur man ytterligare förbättrar organoidernas funktionalitet genom enkel tillbakadragande av tillväxtfaktor och hur man provocerar organoiderna att utsöndra tårvätska genom att utföra en svullnadsanalys. Detta protokoll innehåller dessutom en elektroporeringsbaserad transfektionsmetod för att genetiskt manipulera musorganoider med hjälp av CRISPR-härledda basredigerare. Till skillnad från konventionella Cas9 tillåter användningen av basredigerare modifiering av enstaka baser i genomet utan att generera en dubbelsträngad brytning11,12. Slutligen beskrivs ortotopisk transplantation av humana tårkörtelorganoider till immunbristfälliga möss och den efterföljande histologiska bedömningen av engraftmentet. Denna lacrimal gland organoid toolkit kan användas i forskning om lacrimal körtel regenerering och funktion och för genetisk och inflammatorisk sjukdom modellering.
Detta protokoll beskriver etablering och användning av tårkörtelorganoider för funktionella analyser, mutationsmodellering och transplantation. Vid etablering av mus- och humana lacrimalkörtelorganoider är vävnadsdissociation avgörande. Om vävnaden inte smälts tillräckligt kommer organoidutbytet att vara lågt. Om vävnaden översmälts kommer cellerna att dö och inte växa ut som organoider. Varje vävnad bör smälta med ett specifikt enzym under en viss tid för att säkerställa optimal organoid utväxt14,17,18. Lacrimalkörteln är en ganska mjuk vävnad för vilken en kollagenasuppslutning på 5-10 min i kombination med pipetterbaserad mekanisk dissociation är tillräcklig för att isolera små bitar av vävnad. Om enskilda celler behöver erhållas för tillämpningar såsom encells-RNA-sekvensering kan dissociationen utföras längre tills encellsstadiet uppnås, men dissociationen bör stoppas så snart enskilda celler erhålls för att begränsa eventuell minskning av livsdugligheten. Eftersom vävnadsdissociation är så avgörande är över-digestion den mest troliga orsaken till misslyckandet av lacrimal körtel organoid etablering.
Lämpligt underhåll av lacrimal körtelorganoider är viktigt för deras användning. Långsiktigt underhåll är ett kännetecken för vuxna tårkörtelorganoider som härrör från stamceller, jämfört med inducerade pluripotenta stamcellsderiverade organoider 7,17. För att uppnå långsiktigt underhåll bör regelbunden organoiddelning och medieförändringar utföras. Utan detta börjar organoider differentiera och utveckla minskad stamcellspotential, vilket hindrar deras långsiktiga underhåll7. Vid detta steg igen kan övermatsmältning döda stamcellerna och försämra organoidunderhållet. För regelbundet underhåll krävs inte organoiddissociation i enskilda celler. Men för att generera klonala knock-out organoidlinjer är det viktigt att börja med enstaka celler. Om inte, kommer organoiderna att bestå av en mosaik av celler med olika genetisk bakgrund, vilket gör det omöjligt att analysera effekten av en enda, definierad mutation. Här beskriver vi användningen av en C- > T-basredigerare för att generera stoppkodoner. Denna genomredigerare förlitar sig på närvaron av arginin-, glutamin- eller tryptofankodon inom 12-18 baser från en NGG PAM. När dessa villkor inte är uppfyllda vid utformningen av ett gRNA kan konventionella Cas9- eller C >T-basredigerare med alternativa PAMs användas 7,18. Konventionell Cas9 introducerar dock dubbelsträngade brott som resulterar i indels vid reparation11. Eftersom båda allelerna kan ha olika indels, kräver klongenotypning ytterligare försiktighet. Dekonvolution av de införda modifieringarna bör utföras för att säkerställa att båda allelerna innehåller indels utanför ramen och därmed att organoidklonerna slås ut för den riktade genen19. Fördelen med C> T-basredigerare ligger i det faktum att de kan användas för att modellera punktmutationer som inte nödvändigtvis resulterar i stoppkodoner. De kan till exempel användas för att modellera specifika Pax6-mutationer som finns hos patienter med aniridi för att studera deras inverkan på tårkörtelns fysiologi20.
Lacrimalkörteln utsöndrar den vattenhaltiga delen av tårfilmen1. Tårsekretion kan rekapituleras i humana organoider efter differentiering medierad av tillväxtfaktoruttag och NOTCH-hämning. Under dessa förhållanden genomgår organoider terminal differentiering och kan inte bibehållas ytterligare. Ändå kan differentierade lacrimal körtelorganoider styra utvecklingen av rivinducerande läkemedel i samband med torra ögonsjukdomar, potentiellt i skärmar med hög genomströmning. Den rivningsanalys som presenteras i detta protokoll är den som för närvarande ger den största förändringen i organoidstorlek på kort tid, vilket gör det lättare att kvantifiera i samband med en läkemedelsskärm 7,9,17.
Stamcellsterapi är mycket lovande för tårkörtelregenerering vid torra ögonsjukdomar21. Vuxna stamcellshärledda tårkörtelorganoider kan vara ett källmaterial för sådana tillämpningar. Protokollet som presenteras här resulterar i mänsklig lacrimal körtelorganoid engraftment, mestadels som cystor. Låg organoidgravering kan uppstå på grund av att organoider injiceras på fel plats. Träning av injektionsproceduren med ett färgämne möjliggör spårning av injektionsstället och förbättrar i slutändan injektionsnoggrannheten. Alternativt kan musepidermis skäras för att ha direkt tillgång till tårkörteln, vilket görs hos råttor före22. Den här metoden tar längre tid men kan vara mer exakt. Å andra sidan, med det nuvarande protokollet, integrerades organoiderna inte funktionellt i musens lacrimalkörtel. Liknande resultat har observerats för iPSC-härledd tårkörtelgravering22. Transplantationsmetoden kan förbättras ytterligare genom att skada tårkörteln i förväg, med hjälp av en musmodell med torra ögon, och/eller injicera organoiderna som enstaka celler eller små klumpar. Ändå kan vuxna stamcellshärledda tårkörtelorganoider och den relaterade verktygslådan ligga till grund för framtida tillämpningar inom tårkörtelforskning och regenerativ medicin.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Yorick Post för den inledande utvecklingen av protokollet. Detta arbete stöddes delvis av en utmärkelse från Cancer Research UK Grand Challenge (C6307/A29058) och Mark Foundation for Cancer Research till SPECIFICANCER-teamet.
1.5 mL safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate (DAB) | Sigma-Aldrich | D5637 | CAS: 868272-85-9 , CAUTION, 6 g/L solution can be stored aliquotted at -20 °C |
5x green GoTaq Flexi buffer | Promega | M891A | Store at -20 °C |
A83-01 | Tocris | 2939 | Store at -20 °C, stock at 30 mM, 10000x |
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | store at 4 °C |
Agar plates containing Ampicillin | Hubrecht Institute | ||
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
Autoclave VAPOUR-Line lite | VWR chemicals | ||
B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | Store at -20 °C, 50x |
BD Micro-Fine insulin needle 1 mL | BD Bioscience | 324825 | |
Benchtop microscope DMI1 | Leica | ||
Bovine serum albumine (BSA) | MP biomedicals | 160069 | Store at 4 °C |
BTXpress | BTX | MDS450805 | |
C57BL/6 mice | Hubrecht Institute | ||
Cassettes | Klinipath | 410-02S | |
CellBanker 1 | amsbio | 11910 | Cryopreservation medium, adhere to instructions |
Centrifuge | Eppendorf | ||
Citric acid monohydrate | J.T. Baker | 0088 | CAS: 5949-29-1 |
Collagenase I | Sigma Aldrich | C9407 | Aliquots at 20 mg/mL, 20x, store at -20 °C |
Conical tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 5618-8271 | |
Conical tubes 50 mL | Corning | CLS430828-500EA | |
Coverslips 24 mm x 50 mm | Menzel-Gläzer | BB024050S1 | |
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Growth Factor Reduced, Type 2 – extracellular matrix | R&D Systems, Bio-Techne | 3533-001-02 | Store at -20 °C, keep at 4 °C for up to 1 month |
DAPT | Sigma Aldrich | D5942 | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 1000x |
Disodium hydrogen phosphate anhydrous | VWR chemicals | 28026.292 | CAS: 7558-79-4 |
Di-sodiumhydrogenphosphate dihydrate | Sigma-Aldrich | 71643 | CAS:10028-24-7 |
Dispase | ThermoFisher Scientific | 17105-041 | Aliquots at 50 U/mL, store at -20 °C until use, 400x |
Disposable Scalpel Sterile N° 10 | Swann Morton | 3033838 | |
DM4000 microscope | Leica | ||
dNTPs 25 mM | Promega | U1420 | Mix all 4 nucleotides together, Store at -20 °C |
Dpn1 | New England Biolabs | R0176 | |
Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | 1x |
Easy strainers 70 µm | Greiner | 542170 | |
Electroporation cuvette | Nepagene | EC002S | |
EnVision+/HRP mouse | Agilent | K400111-2 | |
Ethanol 100% | BOOM | 84045206;5000 | CAUTION, Use to prepare other Ethanol dilutions |
Ethanol 70% | BOOM | 84010059.5000 | CAUTION |
Ethanol 96% | BOOM | 84050065.5000 | CAUTION |
EVOS FL Auto 2 Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | Live-imaging brightfield microscrope | |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | Store at -20 °C, stock at 100 mg/mL in base medium, 100x |
Fiji | NIH, Fiji developers | ||
Formaldehyde solution 4% | Sigma-Aldrich | 1.00496 | CAS: 50-00-0, CAUTION |
Forskolin | Tocris | 1099 | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 10000x |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | 100x |
GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7805 | Store at -20 °C |
Haematoxylin | VWR chemicals | 10047105 | Store at room temperature |
HEPES | Gibco | 15630-080 | Store at 4 °C, 100x |
Histocore H and C, Tissue embedding machine | Leica | ||
Hot plate | Meidax | ||
Human nucleolar antigen antibody | Abcam | ab-190710 | |
Hydrochloric acid 5 N | ThermoFisher Scientific | 10605882 | CAS: 7647-01-0, CAUTION |
Hydrogen peroxyde 30% | Chem-lab | CL00.2308.1000 | CAS: 7722-84-1, CAUTION |
Hygromycin B-gold | InvivoGen | ant-hg | Stock at 100 mg/µL, 1000x |
Hygromycin resistance cassette-containing plasmid | Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156 | ||
IsoFlo 100% | Mecan | 5960501 | |
LB medium | Hubrecht Institute | ||
MgCl2 25 mM | Promega | A351H | Store at -20 °C |
Microtome RM2235 | Leica | ||
Midiprep DNA isolation kit | ThermoFisher Scientific | K210005 | |
Miniprep DNA isolation kit | ThermoFisher scientific | K210003 | |
N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Store at -20 °C, stock at 500 mM, 400x |
NEPA21 electroporator | Nepagene | ||
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Store at -20 °C, stock at 1M, 100x |
NOD Scid Gamma (NSG) mice | Hubrecht Institute colony | ||
Noggin conditioned medium | U-Protein Express | Custom order | Store at -20 °C |
Noradrenaline | Sigma Aldrich | A7257 | Store at -20 °C, stock at 100 mM |
Oven | Memmert | Set at 58 °C | |
P20, P200 and P1000 pipettes | Gilson | ||
Paraffin | VWR chemicals | 10048502 | |
Pasteur pipettes, glass plugged | ThermoFisher Scientific | 1150-6973 | |
Pax6_C>T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG | IDT | ||
Pax6_C>T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC | IDT | ||
pCMV_ABEmax_P2A_GFP | Addgene | 112101 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Store at -20 °C |
Pertex | Klinipath | AM-08010 | |
pFYF1320 | Addgene | 47511 | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1000X, store at -20 °C |
Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 10000x |
Petri dish, 10 cm | Greiner | 633102 | |
Q5 buffer | New England Biolabs | B9027S | |
Q5 high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE09050 | Store aliquots at -20 °C |
R-spondin 3 conditioned medium | U-Protein Express | Custom order | Store at -20 °C |
sgRNA Reverse Primer: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG | IDT | ||
Slides | StarFrost | MBB-0302-55A | Adhesive, ground |
Sodium azide | Merck | 8.22335.1000 | CAS: 26628-22-8, CAUTION |
Sodium cytrate dihydrate | J.T. Baker | 0280 | CAS: 6132-04-3 |
Standard Forward Primer: “/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG TTAAAATAAGGC |
IDT | ||
Subcloning efficiency competent cells DH5alpha | Invitrogen | 18265-017 | |
Suspension cell culture plates (24-well) | Greiner Bio-One | 662102 | 24-well |
Suspension cell culture plates (12-well) | Greiner Bio-One | 665102 | 12-well |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | |
TAE buffer | ThermoFisher Scientific | B49 | Stock at 50x, dilute to 1x with ultrapure water |
Transposase-containing plasmid | Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156 | ||
TrypLE Express Enzyme | Invitrogen | 12605-028 | store at 4 °C |
U6_Forward primer: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT | IDT | ||
UltraPure Agarose 1000 | Invitrogen | 16550 | |
Water bath | Tulabo | ||
Xylene | Klinipath | 4055-9005 | CAS: 1330-20-7, CAUTION |
Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 1000x |