複数の小生物からの自動マルチモーダル刺激と同時神経記録
Summary
我々は、多くの カエノラブディティス・エレガンス 線虫からの同時神経活動の柔軟な化学的およびマルチモーダル刺激および記録のための方法を提示する。この方法は、マイクロフルイディクス、オープンソースのハードウェアとソフトウェア、および教師ありの自動データ分析を使用して、適応、時間的抑制、刺激クロストークなどの神経現象の測定を可能にします。
Abstract
蛍光遺伝暗号カルシウム指標は、個々の神経細胞レベルから脳回路全体までの神経動態の理解に大きく貢献しています。しかし、神経反応は、以前の経験、内部状態、または確率的要因によって異なる可能性があるため、一度に多くの個人の神経機能を評価できる方法が必要になります。ほとんどの記録技術は一度に1匹の動物を調べますが、広視野顕微鏡を使用して、ニューロンの記録を数十の カエノラブディティスエレガンス または他のサブミリメートルスケールの生物に一度にスケールアップすることについて説明します。オープンソースのハードウェアとソフトウェアにより、化学的、光学的、機械的、熱的、電磁的刺激など、さまざまな刺激タイプの強度とタイミングを制御する完全に自動化された実験をプログラミングする柔軟性が大幅に向上します。特に、マイクロ流体フローデバイスは、秒未満の時間分解能で化学感覚刺激の正確で再現性のある定量的制御を提供します。次に、NeuroTrackerの半自動データ分析パイプラインは、個人および集団全体の神経反応を抽出して、神経の興奮性とダイナミクスの機能的変化を明らかにします。本論文では、神経細胞の適応、時間的抑制、刺激クロストークの測定例を紹介します。これらの技術は、刺激の精度と再現性を高め、集団の多様性の探索を可能にし、細胞やオルガノイドから生物や植物全体に至るまで、小さな生物系における他の動的蛍光シグナルに一般化できます。
Introduction
カルシウムイメージング技術は、蛍光顕微鏡および標的細胞で発現される遺伝的にコードされたカルシウム指示薬を使用して、in vivo神経ダイナミクスの非侵襲的記録を可能にしました1,2,3。これらのセンサーは通常、GFP-カルモジュリン-M13ペプチド(GCaMP)ファミリーなどの緑色蛍光タンパク質(GFP)を使用して、ニューロンの活性化と細胞内カルシウムレベルの上昇時に蛍光強度を増加させます。カルシウムイメージングは、線虫C.エレガンスにおいて、ニューロンおよび神経回路が生きた行動動物4,5,6,7,8,9,10においてどのように機能するかを調べるために特に強力であり、その透明な性質は光学的アクセスのための外科的プロセスが不要であり、細胞特異的遺伝子プロモーターは目的の細胞への発現を標的とする。これらの技術は、多くの場合、マイクロ流体デバイスを利用し、正確に制御された環境を提供して、生物学的、化学的、および物理的現象を小さな物理的スケールで研究します11,12。神経活動を測定するためのマイクロ流体デバイスは豊富にあり、新しいデザインが継続的に開発されており、研究室で容易に製造できます。ただし、多くの設計では一度に1匹の動物をトラップするため、実験スループットが制限されます7、9、13。神経反応は、以前の経験、ストレスや空腹などの内部状態、または遺伝子発現レベルなどの確率的要因の違いにより、動物によって大きく異なることがよくあります。これらの違いは、多くの動物を同時に刺激して観察し、個体から情報を抽出することができる方法の必要性を確立します4。
さらに、特定の神経調節現象は、刺激が急速に連続して発生したときの応答の短時間の抑制を指す時間的抑制14などの特定の刺激条件下でのみ明らかになる。電気生理学的システムは、この目的のために、例えば、電気パルス電流、電圧、周波数、波形、デューティサイクル、および周期的な刺激列のタイミングを変調して、広い刺激空間にわたって神経活動を駆動することができる。自然に検出された刺激または光遺伝学的システムによる間接刺激は、同様の幅の制御メカニズムの恩恵を受けるでしょう。現在、多くの自然な刺激は、柔軟性を追加するのが遅い商用システムを使用して、匂いの提示や除去などの単純な「オンオフ」の方法で提示されます。しかし、安価なマイクロコントローラは、研究者のニーズに合わせてカスタマイズ可能な方法で、いくつかのタイプの刺激の送達を自動化できるようになりました。マイクロフルイディクスと組み合わせることで、これらのシステムは実験スループットと柔軟性の向上という目標を達成し、さまざまな正確な刺激に対する神経応答を多くの動物で同時に測定できるようになりました4,6。マルチモーダル刺激は、薬物曝露などの直交摂動の前、最中、および後に一貫して刺激するときの神経興奮性の変化を監視することなどによって、ニューロン回路をさらに調べるために使用することができる4。安価でオープンな顕微鏡システムの利点は、科学研究を進める上で明らかですが、実際には、部品の調達、構築、および性能検証の必要性がこれらの技術の採用を妨げる可能性があります。
このプロトコルは、これらの技術的課題のいくつかを軽減することを目的としています。以前のプロトコルはマイクロ流体デバイスの使用と基本的な刺激に焦点を当てていました9、15、17、ここでは、前述のマイクロ流体デバイスを利用するC.エレガンスまたは他の小さな生物における神経イメージングのための柔軟で自動化されたマルチモーダル刺激送達システムの構築と使用について説明します4。オープンソースシステムは、実験を定義するために単純なテキストファイルを介してプログラムされ、NeuroTrackerデータ分析プログラムは、顕微鏡ビデオから神経活動データを半自動的に抽出します。光遺伝学的光感受性イオンチャネル5,6を発現する際に、異なる食品の匂いに応答して、または光に応答して脱分極する化学感覚ニューロンAWAを使用して、時間的抑制、脱抑制、および刺激クロストークを評価する例を使用して、このシステムを実証します。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、さまざまな刺激パターンの時間的に正確な配信を使用して神経活動現象を評価するためのオープンアクセス顕微鏡システムについて説明します。マイクロ流体プラットフォームは、数十匹の動物を顕微鏡の視野に保ちながら、再現性のある刺激を提供します。さまざまな刺激タイミングパターンを簡単にプログラミングできる市販の顕微鏡ソフトウェアパッケージはほ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
これらのプロトコルをテストし、原稿をレビューしてくれたFox Avery と、プログラミングの支援をしてくれた Eric Hall に感謝します。ここに提示された方法のための資金は、全米科学財団1724026(D.R.A.)によって部分的に提供された。
Materials
| Bacterial strains | |||
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Cat# OP50 | |
| Experimental models: Organisms/strains | |||
| C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work | NZ1091, for example | |
| Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies | |||
| 2,3-Butanedione | Sigma-Aldrich | Cat# B85307 | diacetyl, example chemical stimulus |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C3881 | |
| Fluorescein, Sodium salt | Sigma-Aldrich | Cat# F6377 | |
| Glass water repellant | Rain-X | Cat #800002250 | glass hydrophobic treatment (single-use) |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# M2393 | |
| Nematode Growth Medium (NGM) agar | Genesee | Cat #: 20-273NGM | |
| Petri dishes (60 mm) | Tritech | Cat #T3305 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184 | Dow Chemical | Cat# 1673921 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | Cat# P5655 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | Cat# P8281 | |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S7653 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS) | Gelest | CAS# 78560-45-9 | glass hydrophobic treatment (durable) |
| Software and algorithms | |||
| Arduino IDE | Arduino | https://www.arduino.cc/en/software | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Micro-manager | Micro-manager | https://micro-manager.org/ | |
| Microscope control software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl | |
| Neurotracker data analysis software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/Neurotracker | |
| Automated Microscope and Stimulation System | |||
| Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar) | Zeiss | Cat #491237-0012-000 | |
| Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator | Excelitas | Cat #XYLIS | |
| Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera | Hamamatsu | Cat #C11440-22CU | |
| Arduino nano | Arduino | Cat #A000005 | |
| 3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12) | Parker | Cat #LQX12-3W24FF48-000 | Valve 1: Control |
| 2-way normally-closed (NC) Pinch Valve | Bio-Chem Valve Inc | Cat #075P2-S432 | Valve 2: Outflow |
| 3-way Pinch Valve | NResearch | Cat #161P091 | Valve 3: Stimulus selection |
| Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm) | Mightex | Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2 | |
| ValveLink 8.2 digital/manual valve controller | AutoMate Scientific | Cat #01-18 | |
| Wires and connectors | various | See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021) | |
| Microfluidic Device Preparation | |||
| Dremel variable speed rotary cutter 4000 | Dremel | Cat #F0134000AB | Set speed to 5k RPM for cutting glass |
| Dremel drill press rotary tool workstation | Dremel | Cat #220-01 | |
| Diamond drill bit | Dremel | Cat #7134 | |
| Glass slide, 1 mm thick | VWR | Cat #75799-268 | |
| Glass scribe (Diamond scriber) | Ted Pella | Cat #54468 | |
| Luer 3-way stopcock | Cole-Parmer | Cat #EW-30600-07 | |
| Luer 23 G blunt needle | VWR | Cat #89134-100 | |
| Microfluidic device | Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article | N/A | |
| Microfluidic device clamp | Warner Instruments (or machine shop) | P-2 | |
| Microfluidic tubing, 0.02″ ID | Cole-Parmer | Cat #EW-06419-01 | |
| Tube 19 G, 0.5″ | New England Small Tube | Cat #NE-1027-12 |
Riferimenti
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -. H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1, 025008 (2014).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 4266-4273 (2013).
- Larsch, J., et al. A circuit for gradient climbing in C. elegans chemotaxis. Cell Reports. 12 (11), 1748-1760 (2015).
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Automated fluid delivery from multiwell plates to microfluidic devices for high-throughput experiments and microscopy. Scientific Reports. 8, 6217 (2018).
- Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Lawler, D. E., et al. Sleep analysis in adult C. elegans reveals state-dependent alteration of neural and behavioral responses. The Journal of Neuroscience. 41 (9), 1892-1907 (2021).
- Reilly, D. K., Lawler, D. E., Albrecht, D. R., Srinivasan, J. Using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male C. elegans head neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), e56026 (2017).
- Han, X., et al. A polymer index-matched to water enables diverse applications in fluorescence microscopy. Lab on a Chip. 21 (8), 1549-1562 (2021).
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
- Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nature Methods. 8 (7), 599-605 (2011).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Cohen, R. A., Kreutzer, J. S., DeLuca, J., Caplan, B. Temporal Inhibition. Encyclopedia of Clinical Neuropsychology. , 2480-2481 (2011).
- Lawler, D. E., Albrecht, D. R. Monitoring neural activity during sleep/wake events in adult C. elegans by automated sleep detection and stimulation. STAR Protocols. 3 (3), 101532 (2022).
- Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), 10 (2014).
- Lagoy, R. C., Larsen, E., Lawler, D., White, H., Albrecht, D. R. Microfluidic devices for behavioral analysis, microscopy, and neuronal imaging in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 2468, 293-318 (2022).
- NeuroTracker. GitHub Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022)
- NeuroTracker User Guide. GitHub Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022)
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Galotto, G. Chitin triggers calcium-mediated immune response in the plant model Physcomitrella patens. Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (7), 911-920 (2020).
- Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), 166074 (2019).
- Ventimiglia, D., Bargmann, C. I. Diverse modes of synaptic signaling, regulation, and plasticity distinguish two classes of C. elegans glutamatergic neurons. eLife. 6, 31234 (2017).
- Boulin, T. Reporter gene fusions. WormBook. , (2006).
