Estimulação Multimodal Automatizada e Gravação Neuronal Simultânea de Múltiplos Pequenos Organismos
Summary
Apresentamos um método para a estimulação química flexível e multimodal e registro da atividade neural simultânea de muitos vermes Caenorhabditis elegans . Esse método usa microfluídica, hardware e software de código aberto e análise automatizada supervisionada de dados para permitir a medição de fenômenos neuronais como adaptação, inibição temporal e crosstalk de estímulos.
Abstract
Indicadores fluorescentes de cálcio codificados geneticamente têm contribuído muito para a nossa compreensão da dinâmica neural, desde o nível de neurônios individuais até circuitos cerebrais inteiros. No entanto, as respostas neurais podem variar devido à experiência prévia, estados internos ou fatores estocásticos, gerando a necessidade de métodos que possam avaliar a função neural em vários indivíduos ao mesmo tempo. Enquanto a maioria das técnicas de registro examina um único animal de cada vez, descrevemos o uso de microscopia de campo largo para ampliar registros neuronais para dezenas de Caenorhabditis elegans ou outros organismos de escala submilimétrica ao mesmo tempo. Hardware e software de código aberto permitem grande flexibilidade na programação de experimentos totalmente automatizados que controlam a intensidade e o tempo de vários tipos de estímulos, incluindo estímulos químicos, ópticos, mecânicos, térmicos e eletromagnéticos. Em particular, os dispositivos de fluxo microfluídico fornecem controle preciso, repetível e quantitativo de estímulos quimiossensoriais com resolução de tempo inferior a um segundo. O pipeline de análise de dados semi-automatizado do NeuroTracker extrai respostas neurais individuais e populacionais para descobrir mudanças funcionais na excitabilidade e dinâmica neural. Este artigo apresenta exemplos de medidas de adaptação neuronal, inibição temporal e crosstalk de estímulos. Essas técnicas aumentam a precisão e a repetibilidade da estimulação, permitem a exploração da variabilidade populacional e são generalizáveis para outros sinais fluorescentes dinâmicos em pequenos biossistemas, desde células e organoides até organismos inteiros e plantas.
Introduction
Técnicas de imagem com cálcio têm permitido o registro não invasivo da dinâmica neural in vivo em tempo real utilizando microscopia de fluorescência e indicadores de cálcio codificados geneticamente, expressos em células-alvo 1,2,3. Esses sensores normalmente usam uma proteína fluorescente verde (GFP), como a família do peptídeo GFP-calmodulina-M13 (GCaMP), para aumentar a intensidade da fluorescência após a ativação neuronal e níveis elevados de cálcio intracelular. A imagem do cálcio tem sido especialmente poderosa no nematoide C. elegans para examinar como neurônios e circuitos neurais funcionam em animais vivos e comportados 4,5,6,7,8,9,10, pois sua natureza transparente significa que nenhum processo cirúrgico é necessário para o acesso óptico, e promotores gênicos específicos de células têm como alvo a expressão para as células de interesse. Essas técnicas frequentemente utilizam dispositivos microfluídicos, que fornecem ambientes precisamente controlados para estudar fenômenos biológicos, químicos e físicos em pequena escala física11,12. Dispositivos microfluídicos são abundantes para medir a atividade neural, com novos projetos continuamente em desenvolvimento, e eles são prontamente fabricados no laboratório de pesquisa. No entanto, muitos delineamentos aprisionam um único animal de cada vez, limitando o rendimento experimental 7,9,13. As respostas neurais geralmente variam substancialmente entre os animais devido a diferenças na experiência anterior, estados internos, como estresse ou fome, ou fatores estocásticos, como níveis de expressão gênica. Essas diferenças estabelecem a necessidade de métodos que possam simultaneamente estimular e observar muitos animais e extrair informações dosindivíduos4.
Além disso, certos fenômenos neuromodulatórios tornam-se aparentes apenas sob condições específicas de estimulação, como a inibição temporal14, que se refere à supressão breve das respostas quando a estimulação ocorre em rápida sucessão. Sistemas eletrofisiológicos podem conduzir a atividade neural através de um amplo espaço de estímulo para esse fim, modulando, por exemplo, a corrente de pulso elétrico, tensão, frequência, forma de onda, ciclo de trabalho e tempo de trens de estímulos periódicos. A estimulação indireta por estímulos naturalmente detectados ou sistemas optogenéticos se beneficiaria de uma amplitude semelhante de mecanismos de controle. Atualmente, muitos estímulos naturais são apresentados de forma simples “on-off”, como apresentação e remoção de odores, utilizando sistemas comerciais que têm demorado a agregar flexibilidade. No entanto, microcontroladores de baixo custo agora podem automatizar a entrega de vários tipos de estímulos de uma maneira personalizável às necessidades dos pesquisadores. Combinados com a microfluídica, esses sistemas alcançaram o objetivo de aumentar o rendimento experimental e a flexibilidade, permitindo que respostas neurais a uma variedade de estímulos precisos fossem medidas simultaneamente em muitos animais 4,6. A estimulação multimodal pode ser usada para interrogar ainda mais os circuitos neuronais, como por exemplo, monitorando mudanças na excitabilidade neural ao estimular consistentemente antes, durante e após uma perturbação ortogonal, como a exposição a drogas4. Os benefícios de sistemas de microscopia abertos e de baixo custo são claros para o avanço da pesquisa científica, mas, na prática, a necessidade de fornecimento de peças, construção e validação de desempenho pode impedir a adoção dessas técnicas.
Este protocolo visa atenuar alguns destes desafios técnicos. Considerando que protocolos anteriores enfocaram o uso de dispositivos microfluídicos e estimulação básica 9,15,17, descrevemos aqui a construção e o uso de um sistema flexível, automatizado e multimodal de liberação de estímulos para imagens neurais em C. elegans ou outros pequenos organismos utilizando dispositivos microfluídicos previamente descritos4. O sistema de código aberto é programado através de arquivos de texto simples para definir os experimentos, e o programa de análise de dados NeuroTracker extrai semi-automaticamente os dados de atividade neural dos vídeos do microscópio. Demonstramos esse sistema com exemplos de avaliação de inibição temporal, desinibição e crosstalk de estímulos utilizando o neurônio quimiossensorial AWA, que se despolariza em resposta a diferentes odores alimentares ou em resposta à luz ao expressar canais iônicos optogenéticos sensíveis à luz 5,6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, descrevemos um sistema de microscopia de acesso aberto para a avaliação de fenômenos de atividade neural usando a entrega temporalmente precisa de diferentes padrões de estímulo. A plataforma microfluídica fornece estímulos repetíveis enquanto mantém dezenas de animais no campo de visão do microscópio. Poucos pacotes de software de microscopia comercial permitem a fácil programação de vários padrões de temporização de estímulos, e aqueles que o fazem geralmente exigem a entrada manual …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos à Fox Avery por testar esses protocolos e revisar o manuscrito e a Eric Hall pela assistência na programação. O financiamento para os métodos aqui apresentados foi fornecido em parte pela National Science Foundation 1724026 (D.R.A.).
Materials
| Bacterial strains | |||
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Cat# OP50 | |
| Experimental models: Organisms/strains | |||
| C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work | NZ1091, for example | |
| Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies | |||
| 2,3-Butanedione | Sigma-Aldrich | Cat# B85307 | diacetyl, example chemical stimulus |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C3881 | |
| Fluorescein, Sodium salt | Sigma-Aldrich | Cat# F6377 | |
| Glass water repellant | Rain-X | Cat #800002250 | glass hydrophobic treatment (single-use) |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# M2393 | |
| Nematode Growth Medium (NGM) agar | Genesee | Cat #: 20-273NGM | |
| Petri dishes (60 mm) | Tritech | Cat #T3305 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184 | Dow Chemical | Cat# 1673921 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | Cat# P5655 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | Cat# P8281 | |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S7653 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS) | Gelest | CAS# 78560-45-9 | glass hydrophobic treatment (durable) |
| Software and algorithms | |||
| Arduino IDE | Arduino | https://www.arduino.cc/en/software | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Micro-manager | Micro-manager | https://micro-manager.org/ | |
| Microscope control software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl | |
| Neurotracker data analysis software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/Neurotracker | |
| Automated Microscope and Stimulation System | |||
| Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar) | Zeiss | Cat #491237-0012-000 | |
| Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator | Excelitas | Cat #XYLIS | |
| Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera | Hamamatsu | Cat #C11440-22CU | |
| Arduino nano | Arduino | Cat #A000005 | |
| 3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12) | Parker | Cat #LQX12-3W24FF48-000 | Valve 1: Control |
| 2-way normally-closed (NC) Pinch Valve | Bio-Chem Valve Inc | Cat #075P2-S432 | Valve 2: Outflow |
| 3-way Pinch Valve | NResearch | Cat #161P091 | Valve 3: Stimulus selection |
| Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm) | Mightex | Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2 | |
| ValveLink 8.2 digital/manual valve controller | AutoMate Scientific | Cat #01-18 | |
| Wires and connectors | various | See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021) | |
| Microfluidic Device Preparation | |||
| Dremel variable speed rotary cutter 4000 | Dremel | Cat #F0134000AB | Set speed to 5k RPM for cutting glass |
| Dremel drill press rotary tool workstation | Dremel | Cat #220-01 | |
| Diamond drill bit | Dremel | Cat #7134 | |
| Glass slide, 1 mm thick | VWR | Cat #75799-268 | |
| Glass scribe (Diamond scriber) | Ted Pella | Cat #54468 | |
| Luer 3-way stopcock | Cole-Parmer | Cat #EW-30600-07 | |
| Luer 23 G blunt needle | VWR | Cat #89134-100 | |
| Microfluidic device | Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article | N/A | |
| Microfluidic device clamp | Warner Instruments (or machine shop) | P-2 | |
| Microfluidic tubing, 0.02″ ID | Cole-Parmer | Cat #EW-06419-01 | |
| Tube 19 G, 0.5″ | New England Small Tube | Cat #NE-1027-12 |
Riferimenti
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