हमने क्रोनिक लिवर फाइब्रोसिस का एक माउस मॉडल स्थापित किया, जो वायरस-प्रेरित यकृत फाइब्रोसिस पित्त एट्रेसिया (बीए) के यांत्रिक अध्ययन के लिए एक उपयुक्त पशु मॉडल प्रदान करता है और भविष्य के बीए उपचार के लिए एक मंच प्रदान करता है।
बाइलरी एट्रेसिया (बीए) एक घातक बीमारी है जिसमें प्रतिरोधी पीलिया शामिल है, और यह बच्चों में यकृत प्रत्यारोपण के लिए सबसे आम संकेत है। जटिल एटियलजि और अज्ञात रोगजनन के कारण, अभी भी कोई प्रभावी दवा उपचार नहीं हैं। वर्तमान में, रीसस रोटावायरस (आरआरवी) द्वारा प्रेरित क्लासिक बीए माउस मॉडल बीए के रोगजनन का अध्ययन करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला मॉडल है। इस मॉडल को विकास मंदता, त्वचा और श्लेष्म के पीलिया, मिट्टी के मल और गहरे पीले मूत्र की विशेषता है। हिस्टोपैथोलॉजी गंभीर यकृत सूजन और इंट्राहेपेटिक और एक्स्ट्राहेपेटिक पित्त नलिकाओं की रुकावट दिखाती है, जो मानव बीए के लक्षणों के समान हैं। हालांकि, इस मॉडल में अंत-चरण चूहों के यकृत में फाइब्रोसिस की कमी होती है और नैदानिक बीए में यकृत फाइब्रोसिस की विशेषताओं को पूरी तरह से अनुकरण नहीं कर सकता है। प्रस्तुत अध्ययन ने क्रोनिक लिवर फाइब्रोसिस का एक नया बीए माउस मॉडल विकसित किया, जिसमें प्रत्येक इंजेक्शन के बाद 2 दिनों के अंतराल के साथ एंटी-एलवाई 6 जी एंटीबॉडी के 5-10 μg को चार बार इंजेक्ट किया गया। परिणामों से पता चला है कि कुछ चूहों ने समय की अवधि के बाद विशिष्ट फाइब्रोसिस के साथ क्रोनिक बीए का सफलतापूर्वक गठन किया, जिसका अर्थ है कि ये चूहे बीए के वायरस-प्रेरित यकृत फाइब्रोसिस यंत्रवत अध्ययन के लिए एक उपयुक्त पशु मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं और भविष्य के बीए उपचार विकसित करने के लिए एक मंच का प्रतिनिधित्व करते हैं।
बाइलरी एट्रेसिया (बीए) एक गंभीर हेपेटोबिलरी बीमारी है जो अक्सर शिशुओं और छोटे बच्चों में होती है; विशेष रूप से, यह नवजात पीलिया और पीला मल1 के साथ एक ओब्लेरेटिव कोलांगोपैथी के रूप में प्रस्तुत करता है। इसकी नैदानिक विशेषताएं इंट्राहेपेटिक और एक्स्ट्राहेपेटिक पित्त नलिकाओं और प्रगतिशील फाइब्रोसिस के भड़काऊ विनाश हैं, जो अंततः यकृत विफलता2 में विकसित होती हैं। आंकड़ों के अनुसार, एशियाई देशों में बीए की घटना यूरोपीय और अमेरिकी देशों की तुलना में अधिक है, और एशियाई देशों में बीए की घटना 1/8,000 है। बीए के एटियलजि में वायरल संक्रमण, असामान्य पित्त नली विकास, प्रतिरक्षा विकार औरआनुवंशिक विविधताएं शामिल हैं। बीए वाले बच्चों में कोलेस्टेसिस में सुधार के लिए कसाई सर्जरी सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली विधि है, लेकिन अंततः, यह फाइब्रोसिस4 की प्रगति को रोक नहीं सकता है। बीए के लिए वर्तमान उपचार मुख्य रूप से यकृत प्रत्यारोपण पर निर्भर करता है, जो यकृत स्रोतों की कमी से सीमित है। बीए के रोगजनन का गहन अध्ययन इस बीमारी की चुनौतियों को हल करने का सबसे सीधा साधन है। हालांकि, बीए के रोगजनन पर अध्ययन मुख्य रूप से बीए पशु मॉडल पर निर्भर करता है, और एक उपयुक्त पशु मॉडल का चयन करना महत्वपूर्ण है।
बीए के अधिकांश हिस्टोपैथोलॉजिकल अध्ययनों से पता चला है कि पित्त नली हाइपरप्लासिया (बीडीपी), पित्त घनास्त्रता, और पोर्टल नस फाइब्रोसिस बीए की सबसे महत्वपूर्ण रोग संबंधी विशेषताएं हैं, और विभिन्न ग्रेड की अन्य रोग संबंधी विशेषताएं एक ही समय में मौजूद हैं, जैसे कि पोर्टल भड़काऊ सेल घुसपैठ और हेपेटोसाइट सूजन 5,6।. वर्तमान में, विभिन्न प्रकार के माउस मॉडल हैं जो बीए की नकल करते हैं, जैसे कि क्रोनिक 3,5-डाई-थोक्सीकार्बोनिल-1,4-डाइहाइड्रोकोलिडीन (डीडीसी)-फेड माउस मॉडल जिसमें सेगमेंटल पित्त नली रुकावट और पेरिकोलैंगिटिस शामिल है जिसमें एक्स्ट्राहेपेटिक पित्त नलिकाएं7 शामिल हैं और कार्बन टेट्राक्लोराइड8 के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के साथ यकृत फाइब्रोसिस का माउस मॉडल। पित्त नली बंधाव (बीडीएल) मॉडल को पीलिया और रैपिड पोर्टल वेन फाइब्रोसिस9 की विशेषता है। अल्फा-नेफ्थाइलिसोथियोसाइनेट (एएनआईटी)-खिलाया माउस मॉडल इंट्राहेपेटिक पित्त नली और हेपेटोसाइटचोट 10 तक सीमित चोलंगाइटिस के साथ प्रस्तुत करता है। लंबे समय तक पीलिया के साथ एक माउस मॉडल देरी से रीसस रोटावायरस (आरआरवी) टीकाकरण11 से प्रेरित होता है। यद्यपि विभिन्न प्रकार के पशु मॉडल हैं, विशेष रूप से माउस मॉडल, प्रत्येक मॉडल की अपनी सीमाएं हैं। वे केवल बीए की रोग विशेषताओं के हिस्से का अनुकरण कर सकते हैं, जैसे कि पित्त एट्रेसिया की प्रक्रिया में तीव्र सूजन या यकृत फाइब्रोसिस, और कोई मॉडल नहीं है जो बीए की रोग प्रक्रिया और रोग संबंधी विशेषताओं के साथ अत्यधिक सुसंगत है।
क्लासिक बीए माउस मॉडल आरआरवी द्वारा प्रेरित है, और यह मॉडल मनुष्यों में बीए के लिए सबसे समान मॉडल है। हालांकि, जबकि आरआरवी-प्रेरित बीए मॉडल चूहे एक्स्ट्राहेपेटिक बाइलरी एट्रेसिया के कुछ लोगों के समान नैदानिक लक्षण और रोग संबंधी विशेषताएं दिखाते हैं, इस मॉडल में यकृत फाइब्रोसिस का अभाव है, जो बीए तंत्र के गहन अध्ययन औरनए उपचार के विकास को बहुत सीमित करता है। इसलिए, इस अध्ययन ने क्रोनिक लिवर फाइब्रोसिस का एक नया बीए माउस मॉडल विकसित किया। जन्म के दिन आरआरवी टीकाकरण से पहले एंटी-एलवाई 6 जी एंटीबॉडी को इंट्रापरिटोनियल रूप से इंजेक्ट किया गया था। फिर, एंटी-एलवाई 6 जी एंटीबॉडी के 5-10 μg को चार बार इंजेक्ट किया गया, प्रत्येक इंजेक्शन के बीच 2 दिनों के अंतराल के साथ। चूहों के बीए लक्षणों में सुधार हुआ, जीवित रहने का समय लंबा था, और चूहों ने क्रोनिक फाइब्रोसिस चरण में प्रवेश किया। यह मॉडल न केवल बीए की तीव्र चरण प्रतिक्रिया का अनुकरण करता है, बल्कि यकृत और प्रगतिशील फाइब्रोसिस की प्रक्रियाओं की नकल भी करता है। इस प्रकार, यह बीए के यंत्रवत अध्ययन के लिए एक अधिक उपयुक्त पशु मॉडल है, और यह बीए के लिए भविष्य के उपचार विकसित करने के लिए एक सैद्धांतिक आधार प्रदान कर सकता है।
जीआर -1 अणु एक माइलॉयड-व्युत्पन्न सेल सतह मार्कर है जो मूल रूप से न्यूट्रोफिल13 में व्यक्त किया जाता है। एंटी-लाइ 6 जी एंटीबॉडी की कमी 90% से अधिक न्यूट्रोफिल को कम करती है और अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा सक्रिय प्रतिक्रिया को बदल देती है। जीआर -1 + सेल आबादी के कार्यों को विशिष्ट स्कैवेंजिंग एंटीबॉडी का उपयोग करके विभिन्न अध्ययनों में रिपोर्ट किया गया है, जिसमें साइटोकिन्स और मध्यस्थ प्रतिरक्षा सुरक्षा14 पर अलग-अलग प्रभाव की पहचान की गई है। हमने आरआरवी-टीकाकृत बीए माउस मॉडल में जीआर -1 + कोशिकाओं के कार्य का अध्ययन किया है। हालांकि, चूंकि जीआर -1 अणु मनुष्यों में व्यक्त नहीं किया गया है, इसलिए बीए रोगियों15 में एक समान अणु, सीडी 177 का अध्ययन किया गया है। हमारा डेटा जीआर -1 + सेल आबादी के महत्व को साबित करता है, विशेष रूप से बीमारी के पुराने फाइब्रोटिक चरण में, और संभावित बीए उपचारों की जांच के लिए एक उपयुक्त पशु मॉडल प्रदान करता है।
हमारे अध्ययन में, हमने तीव्र बीए सिंड्रोम में सुधार करने, जीवित रहने की दर को बढ़ाने और बीए चूहों को पुराने चरण में प्रवेश करने में सक्षम बनाने के लिए आरआरवी से संक्रमित पित्त एट्रेसिया के माउस मॉडल में जीआर -1 + कोशिकाओं को खत्म करने या कम करने के लिए एंटी-एलवाई 6 जी एंटीबॉडी का उपयोग किया। एंटीबॉडी खुराक को कम करने से हेपेटिक फाइब्रोसिस के साथ क्रोनिक बीए हो सकता है, जो इंगित करता है कि जीआर -1 + कोशिकाओं की संख्या तीव्र और पुरानी चरणों में बीए के परिणाम को बदल देती है। हमारे पिछले अध्ययन में, एंटी-एलवाई 6 जी एंटीबॉडी के प्रशासन के बाद जीआर -1 + कोशिकाओं को कम कर दिया गया था, और बीए चूहों की समग्र जीवित रहने की स्थितिमें सुधार हुआ था। इसी समय, यह बताया गया है कि जीआर -1 + मैक्रोफेज19, जीआर -1 + न्यूट्रोफिल 20, जीआर -1 + माइलॉयड कोशिकाएं21, और जीआर -1 + ग्रैनुलोसाइट्स कुछ पशु मॉडल 22 में फाइब्रोसिस को बढ़ा सकते हैं। हालांकि, इस अध्ययन में, चूहों में जीआर -1 + कोशिकाओं को एंटी-एलवाई 6 जी एंटीबॉडी की कम खुराक के साथ आंशिक रूप से समाप्त कर दिया गया था, और कोलेजन जमा बने रहे। नतीजतन, बीमारी को अधिक अच्छी तरह से संबोधित करने के लिए अधिक समय की आवश्यकता हो सकती है।
एंटी-एलवाई 6 जी एंटीबॉडी के आवेदन ने सूजन को कम कर दिया, आंशिक रूप से पित्त नलिकाओं को संरक्षित किया, और चूहों में तीव्र बीए-प्रेरित मृत्यु को रोका। हालांकि, केवल 20% से 30% चूहों ने बीए के पुराने चरण में प्रवेश किया; यह समय बिंदु और एंटी-एलवाई 6 जी एंटीबॉडी के इंजेक्शन की संख्या से संबंधित हो सकता है। हमें सफलता दर में सुधार के लिए इस महत्वपूर्ण बिंदु का और पता लगाने की आवश्यकता है। इसके अलावा, हम मानते हैं कि न केवल जीआर -1 + कोशिकाएं बल्कि अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाएं भी महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती हैं, जैसे कि एनके कोशिकाएं, टी कोशिकाएं, बी कोशिकाएं और मैक्रोफेज।
प्रोटोकॉल के लिए, कुछ विवरणों पर ध्यान देने की आवश्यकता है। (i) इंजेक्शन वाली दवाओं के रिसाव से बचने के लिए, हम 0.33 मिमी व्यास की सुई के साथ 1 एमएल इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करते हैं, क्योंकि सुई का व्यास छोटा होता है, और सिरिंज में सुई छेद छोटा होता है, जो दवा रिसाव की संभावना को कम करने के लिए अनुकूल होते हैं। (ii) इंजेक्शन से पहले, माउस को स्थानांतरित करने से रोकने, दवा रिसाव से बचने के लिए तय किया जाना चाहिए, और इस प्रकार, प्रयोगात्मक प्रभाव को और सुनिश्चित करना चाहिए। (iii) दवा इंजेक्शन के दौरान, हमने जहां तक संभव हो माउस लिवर की सतह या निचले मार्जिन में दवा को इंजेक्ट किया ताकि दवा पेट में प्रवेश कर जाए और प्रभावी होने के लिए यकृत से पूरी तरह से संपर्क किया जा सके। (iv) इंजेक्शन आमतौर पर माउस की ऊपरी दाईं जांघ से बनाया जाता है, क्योंकि नवजात माउस का पेट और प्लीहा बाएं पेट में होता है, और पेट दूध से भरा होता है। यदि सुई बाईं ओर से डाली जाती है, तो यह आसानी से पेट को पंचर कर सकती है, जिससे दूध पेट में बह सकता है, या प्लीहा पंचर हो सकता है, जिससे रक्तस्राव होता है।
CD177 Ly6G का एक होमोलॉग है, और बीए रोगियों में CD177 की अभिव्यक्ति की जांच की गई है। सीडी 177 का उपयोग बच्चों में बीए के प्रारंभिक निदान के लिए एक मार्कर के रूप में किया जा सकता है, यह दर्शाता है कि सीडी 177 + कोशिकाएं बीए23 के पाठ्यक्रम में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। आरएनए अनुक्रमण डेटा का विश्लेषण करके, हमारी टीम ने पाया कि सीडी 177 कोशिकाएं जीआर -1 + कोशिकाओं की प्रमुख आबादी थीं; इस बीच, आरआरवी के साथ टीका लगाए गए सीडी 177−/- बीएएलबी / सी चूहों ने बीए की शुरुआत में देरी दिखाई और रुग्णता और मृत्यु दरको कम किया। इस प्रकार, हमारे क्रोनिक बीए माउस मॉडल में बीए के रोगजनन और रोग की प्रगति का अध्ययन करने के लिए स्पष्ट फायदे हैं; यह बीए के लिए संभावित उपचार का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त पशु मॉडल भी प्रदान करता है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81974056) से आरजेड और चीन के राष्ट्रीय प्रकृति युवा फाउंडेशन (82101808) और गुआंगज़ौ (नंबर 202102020196) के विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना परियोजना से जेडएल तक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Balb/c mouse | Guangdong Skarjingda Biotechnology Co., LTD | 20221000112 | |
rat anti-mouse Ly6G | Bio X Cell | clone 1A8 | West Lebanon, NH |
rat anti-mouse cytokeratin 19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | clone TROMA III | Iowa City, IA |
rat anti-mouse F4/80 | R&D Systems | MAB5580 | Minneapolis, MN |
RRV strain | ATCC | MMU 18006 | Manassas, VA |
Fluorescent stereomicroscope | Olympus | SZX7 | |
Leica light microscopy | Leica Microsystems | Leica DMI8+DFC7000T | Wetzlar, Germany |
Hitachi Pre-Analytical Process Automation System | Hitachi | 7600 Clinical Analyzer | Tokyo, Japan |
Isoflurane anesthetic | RWD | R510-22-10 | |
Rhodamine 123 | Sigma-Aldrich | 83702 | |
sirius red dye | Leagene | DC0041 | |
paraffin microtome | Leica Microsystems | RM2235 | |
neutral gum | Solarbio | G8590 |