BS3 Chemical Crosslinking Assay: Bewertung der Wirkung von chronischem Stress auf die Präsentation desGABA-A-Rezeptors auf der Zelloberfläche im Gehirn von Nagetieren
Summary
Der BS3 Chemical Crosslinking Assay zeigt eine reduzierte Expression desGABA-A-Rezeptors auf der Zelloberfläche im Gehirn von Mäusen unter chronischen psychosozialen Stressbedingungen.
Abstract
Angst ist ein Gefühlszustand, der das Verhalten von Tieren, einschließlich der kognitiven Funktionen, variabel beeinflusst. Verhaltensauffällige Angstzustände werden im gesamten Tierreich beobachtet und können entweder als adaptive oder maladaptive Reaktionen auf eine Vielzahl von Stressmodalitäten erkannt werden. Nagetiere bieten ein bewährtes experimentelles Modell für translationale Studien, die sich mit den integrativen Mechanismen der Angst auf molekularer, zellulärer und Schaltkreisebene befassen. Insbesondere löst das Paradigma des chronischen psychosozialen Stresses maladaptive Reaktionen aus, die angst-/depressive Verhaltensphänotypen nachahmen, die zwischen Menschen und Nagetieren analog sind. Während frühere Studien signifikante Auswirkungen von chronischem Stress auf den Neurotransmittergehalt im Gehirn zeigen, ist die Wirkung von Stress auf den Neurotransmitterrezeptorspiegel nur unzureichend untersucht. In diesem Artikel stellen wir eine experimentelle Methode zur Quantifizierung der neuronalen Oberflächenniveaus von Neurotransmitterrezeptoren in Mäusen unter chronischem Stress vor, wobei wir uns insbesondere auf Gamma-Aminobuttersäure (GABA)-Rezeptoren konzentrieren, die an der Regulation von Emotionen und Kognition beteiligt sind. Mit Hilfe des membranundurchlässigen irreversiblen chemischen Vernetzers Bissulfosuccinimidylsuberat (BS3) zeigen wir, dass chronischer Stress die Oberflächenverfügbarkeit vonGABA-A-Rezeptoren im präfrontalen Kortex signifikant herunterreguliert. Die neuronalen Oberflächenniveaus von GABA-A-Rezeptoren sind der geschwindigkeitsbegrenzende Prozess für die GABA-Neurotransmission und könnten daher als molekularer Marker oder Proxy für den Grad angst-/depressiver Phänotypen in experimentellen Tiermodellen verwendet werden. Dieser Vernetzungsansatz ist auf eine Vielzahl von Rezeptorsystemen für Neurotransmitter oder Neuromodulatoren anwendbar, die in jeder Gehirnregion exprimiert werden, und soll zu einem tieferen Verständnis der Mechanismen beitragen, die Emotionen und Kognition zugrunde liegen.
Introduction
Neurotransmitterrezeptoren sind entweder an der Oberfläche der neuronalen Plasmamembran oder intrazellulär auf den Endomembranen (z. B. dem Endosom, dem endoplasmatischen Retikulum [ER] oder dem trans-Golgi-Apparat) lokalisiert und pendeln dynamisch zwischen diesen beiden Kompartimenten, abhängig von intrinsischen physiologischen Zuständen in Neuronen oder als Reaktion auf extrinsische neuronale Netzwerkaktivitäten 1,2. Da neu sezernierte Neurotransmitter ihre physiologischen Funktionen in erster Linie über den oberflächenlokalisierten Rezeptorpool hervorrufen, sind die Oberflächenrezeptorspiegel für einen bestimmten Neurotransmitter eine der kritischen Determinanten seiner Signalkapazität innerhalb des neuronalen Schaltkreises3.
Es stehen mehrere Methoden zur Verfügung, um den Oberflächenrezeptorspiegel in kultivierten Neuronen zu überwachen, darunter der Oberflächenbiotinylierungsassay4, der Immunfluoreszenz-Assay mit einem spezifischen Antikörper unter nicht-permeabilisierten Bedingungen5 oder die Verwendung eines Rezeptortransgens, das genetisch mit einem pH-empfindlichen fluoreszierenden optischen Indikator (z. B. pHluorin) fusioniert ist6. Im Gegensatz dazu sind diese Ansätze bei der Bestimmung von Oberflächenrezeptorspiegeln in vivo entweder begrenzt oder unpraktisch. Beispielsweise ist das Oberflächenbiotinylierungsverfahren aufgrund seines relativ hohen Preises und der nachfolgenden Schritte, die für die Reinigung der biotinylierten Proteine auf Avidin-konjugierten Beads erforderlich sind, möglicherweise nicht für die Verarbeitung großer Mengen und Probenzahlen von In-vivo-Hirngewebe geeignet. Für Neuronen, die in eine dreidimensionale Gehirnarchitektur eingebettet sind, können eine geringe Zugänglichkeit von Antikörpern oder Schwierigkeiten bei der mikroskopischen Quantifizierung eine erhebliche Einschränkung für die Beurteilung der Oberflächenrezeptorkonzentrationen in vivo darstellen. Um die Verteilung von Neurotransmitterrezeptoren in intakten Gehirnen sichtbar zu machen, könnten nicht-invasive Methoden, wie die Positronen-Emissions-Tomographie, verwendet werden, um die Rezeptorbelegung zu messen und die Oberflächenrezeptorspiegel abzuschätzen7. Dieser Ansatz hängt jedoch entscheidend von der Verfügbarkeit spezifischer Radioliganden, teurer Ausrüstung und speziellem Fachwissen ab, was ihn für den routinemäßigen Einsatz für die meisten Forscher weniger zugänglich macht.
Hier beschreiben wir eine einfache, vielseitige Methode zur Messung von Oberflächenrezeptorspiegeln in experimentellen Tiergehirnen ex vivo unter Verwendung eines wasserlöslichen, membranundurchlässigen chemischen Vernetzers, Bis(sulfosuccinimidyl)suberat (BS3)8,9. BS3 zielt auf primäre Amine in der Seitenkette von Lysinresten ab und kann Proteine in unmittelbarer Nähe zueinander kovalent vernetzen. Wenn Hirnschnitte aus einer Region von Interesse frisch präpariert und in einem BS3-haltigen Puffer inkubiert werden, werden die Rezeptoren auf der Zelloberfläche mit benachbarten Proteinen vernetzt und verwandeln sich so in Spezies mit höherem Molekulargewicht, während die intrazellulären Endomembran-assoziierten Rezeptoren unverändert bleiben. Daher können die Oberflächen- und intrazellulären Rezeptorpools durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) getrennt und mittels Western Blot unter Verwendung von Antikörpern, die für den zu untersuchenden Rezeptor spezifisch sind, quantifiziert werden.
Unpredictable chronic mild stress (UCMS) ist ein etabliertes experimentelles Paradigma zur Induktion von chronischem psychosozialem Stress bei Nagetieren10. UCMS löst angst-/depressive Verhaltensphänotypen und kognitive Defizite durch die Modulation einer Reihe von Neurotransmittersystemen aus, einschließlich GABA und seiner Rezeptoren10,11. Insbesondere der α5-Untereinheit-enthaltende GABA-A-Rezeptor (α5-GABAA R) ist an der Regulation des Gedächtnisses und der kognitiven Funktionen beteiligt12,13, was auf eine mögliche Beteiligung veränderter Funktionen dieser Untereinheit an UCMS-induzierten kognitiven Defiziten hindeutet. In diesem Protokoll haben wir den BS3-Crosslinking-Assay verwendet, um die Konzentrationen von oberflächenexprimiertem α5-GABAAR im präfrontalen Kortex von Mäusen, die UCMS ausgesetzt waren, im Vergleich zu nicht gestressten Kontrollmäusen zu quantifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obwohl die Auswirkungen von chronischem psychosozialem Stress auf Verhaltensweisen (d. h. Emotionalität und kognitive Defizite) und molekulare Veränderungen (d. h. reduzierte Expression von GABAergen Genen und damit einhergehende Defizite in der GABAergen Neurotransmission) gut dokumentiert sind10, müssen die Mechanismen, die diesen Defiziten zugrunde liegen, weiter untersucht werden. Insbesondere angesichts der kürzlich durchgeführten Studie, die zeigt, dass chronischer Stress das neuronale …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken den Mitarbeitern der CAMH-Tierklinik für die Betreuung der Tiere während der gesamten Studiendauer. Diese Arbeit wurde unterstützt vom Canadian Institute of Health Research (CIHR Project Grant #470458 an T.T.), dem Discovery Fund des CAMH (an T.P.), der National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression (NARSAD Award #25637 an E.S.) und dem Campbell Family Mental Health Research Institute (an E.S.). E.S. ist die Gründerin von Damona Pharmaceuticals, einem Biopharmaunternehmen, das sich der Einführung neuartiger GABAerger Verbindungen in die Klinik verschrieben hat.
Materials
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 10x TBS | Bio-Rad | 1706435 | |
| 2.5 M (45%, w/v) Glucose | Sigma | G8769 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| 4x SDS sample buffer (Laemmli) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3) | Pierce | A39266 | No-Weigh Format; 10 x 2 mg |
| Brain matrix | Ted Pella | 15003 | For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| Curved probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Gross Anatomy Probe; angled 45 |
| Deionized water | milli-Q | EQ 7000 | Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb] |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | |
| Filter paper (3MM) | Whatman | 3030-917 | |
| Forceps (large) | Fine Science Tools | 11152-10 | Extra Fine Graefe Forceps |
| Forceps (small) | Fine Science Tools | 11251-10 | Dumont #5 Forceps |
| GABA-A R alpha 5 antibody | Invitrogen | PA5-31163 | Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking |
| GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody | R&D Systems | PPS027 | Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat |
| Glycine | Sigma | W328707 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Bio-Rad | 1721019 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma | M2670 | |
| Nonidet-P40, substitute (NP-40) | SantaCruz | 68412-54-4 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Scissors (large) | Fine Science Tools | 14007-14 | Surgical Scissors – Serrated |
| Scissors (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | Fine Scissors – Sharp |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S9888 | |
| Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) | Qsonica | 15338284 | |
| Table-top refregerated centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Tissue punch (ID 1 mm) | Ted Pella | 15110-10 | Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm |
| Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer | Bio-Rad | 10026938 | |
| Tube rotator (LabRoller) | Labnet | H5000 |
Riferimenti
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