यहां, हम मॉडल जीव सी एलिगेंस का उपयोग करके भ्रूण व्यवहार्यता और उत्पादित भ्रूण (ब्रूड) की कुल संख्या निर्धारित करने के लिए एक सामान्य विधि प्रस्तुत करते हैं।
केनोरहाब्डिस एलिगेंस अर्धसूत्रीविभाजन, निषेचन और भ्रूण के विकास के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल जीव है। एलिगेंस स्व-निषेचित हेर्मैफ्रोडाइट्स के रूप में मौजूद हैं, जो संतान के बड़े ब्रूड का उत्पादन करते हैं- जब नर मौजूद होते हैं, तो वे क्रॉस संतान के बड़े ब्रूड भी पैदा कर सकते हैं। अर्धसूत्रीविभाजन, निषेचन और भ्रूणजनन में त्रुटियों को बाँझपन, कम प्रजनन क्षमता या भ्रूण घातकता के फेनोटाइप के रूप में तेजी से मूल्यांकन किया जा सकता है। यह लेख सी एलिगेंस में भ्रूण व्यवहार्यता और ब्रूड आकार निर्धारित करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। हम प्रदर्शित करते हैं कि एक व्यक्तिगत संशोधित यंगरेन, केवल बैक्टो-पेप्टोन (एमवाईओबी) प्लेट पर एक कीड़ा चुनकर इस परख को कैसे स्थापित किया जाए, व्यवहार्य संतान और गैर-व्यवहार्य भ्रूण की गणना करने के लिए उपयुक्त समय सीमा स्थापित करें, और समझाएं कि जीवित कृमि नमूनों की सटीक गणना कैसे करें। इस तकनीक का उपयोग स्वयं-निषेचित हेर्मैफ्रोडाइट्स के साथ-साथ संभोग जोड़े द्वारा क्रॉस-निषेचन में व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। ये अपेक्षाकृत सरल प्रयोग नए शोधकर्ताओं के लिए आसानी से अपनाए जा सकते हैं, जैसे कि स्नातक छात्र और प्रथम वर्ष के स्नातक छात्र।
यूकेरियोटिक जीवों में यौन प्रजनन के लिए कार्यात्मक युग्मकों के उत्पादन की आवश्यकता होती है जो निषेचन की प्रक्रिया के माध्यम से भ्रूण बनाने के लिए विलय हो जाते हैं। मातृ और पैतृक युग्मक, डिंब (अंडे), और शुक्राणु विशेष कोशिका विभाजन और अर्धसूत्रीविभाजन और गैमेटोजेनेसिस1 की भेदभाव प्रक्रियाओं के माध्यम से बनाए जाते हैं। अर्धसूत्रीविभाजन एक एकल द्विगुणित कोशिका से शुरू होता है और बेटी कोशिकाओं के गठन के साथ समाप्त होता है जिसमें मूल पैतृक कोशिका के गुणसूत्रों की आधी संख्या होती है। स्वतंत्र वर्गीकरण और क्रॉसओवर पुनर्संयोजन के माध्यम से आनुवंशिक सामग्री के फेरबदल के लिए प्लोइडी की कमी से, अर्धसूत्रीविभाजन कई महत्वपूर्ण कार्य करता है1. अर्धसूत्रीविभाजन के भीतर त्रुटियों के परिणामस्वरूप एन्यूप्लोइडी हो सकती है, जिसमें एक युग्मक के भीतर बहुत अधिक या बहुत कम गुणसूत्र होते हैं। एन्यूप्लोइडी की घटनाओं का मानव स्वास्थ्य पर जबरदस्त प्रभाव पड़ता है, क्योंकि क्रोमोसोमल असंतुलन गर्भपात और विकास संबंधी विकारों जैसे डाउन सिंड्रोम और एडवर्ड्ससिंड्रोम 2 का एक प्रमुख कारण है।
निषेचन वह प्रक्रिया है जिसके द्वारा मातृ और पैतृक युग्मक एक नया जीव उत्पन्न करने के लिए फ्यूज होतेहैं। युग्मक-युग्मक पहचान को युग्मक सतह3 पर प्रोटीन द्वारा सुगम बनाया जाता है। युग्मक संगतता के साथ त्रुटियां बांझपन का कारण बनती हैं क्योंकि शुक्राणु और अंडा संलयन आगे बढ़ने में असमर्थ है। अंडाणु के साथ शुक्राणु का संलयन कई घटनाओं को ट्रिगर करता है जो एक सक्रिय भ्रूण के उचित गठन की ओर ले जाता है जो माइटोटिकडिवीजनों के माध्यम से एकल-कोशिका भ्रूण से पूरी तरह कार्यात्मक बहुकोशिकीय जीव तक विकास यात्रा शुरू कर सकता है। भ्रूणजनन के दौरान, आणविक घटनाएं जो विकास को नियंत्रित करती हैं, उन्हें जीव के उचित विकास को सक्षम करने के लिए कसकर विनियमित और सटीक समय दिया जानाचाहिए। प्रारंभिक विकास के दौरान उचित सेलुलर भेदभाव महत्वपूर्ण है क्योंकि जीव एक प्लुरिपोटेंट भ्रूण से पूरी तरह से विकसित जीव में संक्रमण करता है। इन घटनाओं की जटिलताओं के कारण, व्यवधान ों से विकास संबंधी दोष हो सकते हैं जिसके परिणामस्वरूप भ्रूण घातकता होती है।
केनोरहाब्डिस एलिगेंस अर्धसूत्रीविभाजन, निषेचन और भ्रूण के विकास का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल जीव है। एलिगेंस एक पारदर्शी निमेटोड है जिसमें दो लिंग, नर और हेर्मैफ्रोडाइट्स होते हैं। एलिगेंस हेर्मैफ्रोडाइट्स, जो आत्म-निषेचन में सक्षम हैं, प्रमुख लिंग 6,7 हैं। हेर्मैफ्रोडाइट गोनैड पहले चौथे लार्वा (एल 4) चरण के दौरान शुक्राणु का उत्पादन करता है, जो शुक्राणु में संग्रहीत होते हैं। एल 4 से वयस्कता संक्रमण में, रोगाणु रेखा अंडाणुओं के उत्पादन में बदल जाती है, जिसे बाद में संग्रहीत शुक्राणु के माध्यम से निषेचित किया जाता है। नर, जो 0.2% से कम की दर से हेर्मैफ्रोडाइट्स में उत्पन्न होते हैं, केवल शुक्राणु का उत्पादन करते हैं और हेर्मैफ्रोडाइट्स के साथ संभोग कर सकते हैं। क्रॉस-फर्टिलाइजेशन पर, पुरुष शुक्राणु अंडाणुओं के निषेचन में हेर्मैफ्रोडाइट शुक्राणु से आगे निकल जातेहैं। यह स्व-निषेचन स्टॉक के माध्यम से होमोजीगस उत्परिवर्ती के अपेक्षाकृत आसान रखरखाव और आनुवंशिक क्रॉस के माध्यम से आनुवंशिक जोड़तोड़ के लिए अनुमति देता है। दो लिंग पुरुष और महिला रोगाणु रेखाओं में अर्धसूत्रीविभाजन के बीच अंतर की खोज करने वाले अध्ययनों की अनुमति देते हैं। एलिगेंस और इसके अंडों की पारदर्शी प्रकृति के कारण, प्रतिदीप्ति इमेजिंग तकनीकों का उपयोग करके जीवित, बरकरार जानवरों में अर्धसूत्रीविभाजन, गैमेटोजेनेसिस, निषेचन और भ्रूणजनन की प्रक्रियाओं का अध्ययन किया जा सकता है।
जीन में नए उत्परिवर्तन का विश्लेषण करते समय जो सी एलिगेंस में अर्धसूत्रीविभाजन, निषेचन और / या भ्रूण के विकास में भूमिका निभा सकते हैं, एक महत्वपूर्ण पहला कदम भ्रूण व्यवहार्यता और ब्रूड आकार का निर्धारण कर रहा है क्योंकि इन प्रक्रियाओं में त्रुटियां अक्सर व्यवहार्य संतान के उत्पादन में विफलता या कमी का कारण बनती हैं। यह पेपर प्रजनन क्षमता, भ्रूण की व्यवहार्यता, और ब्रूड आकार का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो या तो स्वयं-निषेचित हेर्मैफ्रोडाइट्स या हेर्मैफ्रोडाइट्स और पुरुषों के बीच क्रॉस से होता है। जबकि इस क्लासिक परख का उपयोग कई सी एलिगेंस अध्ययनों में किया गया है, हम सेटअप और सटीक परिमाणीकरण के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, संभोग और संतान उत्पादन की अनुमति देने के लिए व्यक्तिगत कीड़े या नर / हेर्मैप्रोडाइट जोड़े को अलग किया जाता है। व्यवहार्य संतान और गैर-व्यवहार्य भ्रूण की संख्या निर्धारित करने के लिए दिनों की एक श्रृंखला में संतति उत्पादन और व्यवहार्यता देखी जाती है। प्रयोग के समापन पर, भ्रूण व्यवहार्यता प्रतिशत और कुल ब्रूड आकार की गणना करने के लिए अलग-अलग ब्रूड का विश्लेषण किया जाता है।
यौन प्रजनन प्रजातियों के प्रसार के लिए अर्धसूत्रीविभाजन के माध्यम से अगुणित युग्मकों (यानी, अंडे और शुक्राणु) के गठन की आवश्यकता होती है, जो तब निषेचन में एकीकृत होते हैं, द्विगुणित गुणसूत्र संख्या को बहाल करते हैं और भ्रूण के विकास की शुरुआत करते हैं। इनमें से किसी भी प्रक्रिया में त्रुटियां बांझपन, भ्रूण घातकता और / या जन्म दोष का कारण बन सकती हैं। एलिगेंस यौन प्रजनन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है। जीन उत्परिवर्तन या जीन अभिव्यक्ति वध (जैसे, आरएनए हस्तक्षेप) के प्रभावों का मूल्यांकन भ्रूण व्यवहार्यता और ऊपर वर्णित ब्रूड साइज़िंग परख का उपयोग करके अपेक्षाकृत जल्दी और आसानी से किया जा सकता है। हमने इन विधियों का उपयोग मियोटिक क्रोमोसोम अलगाव और निषेचन / अंडा सक्रियण10,11,12 में शामिल जीन के प्रारंभिक लक्षण वर्णन के लिए किया है। भ्रूण की व्यवहार्यता या ब्रूड आकार में देखी गई कमी अर्धसूत्रीविभाजन, गैमेटोजेनेसिस, निषेचन या भ्रूणजनन में व्यवधान को इंगित करती है।
चूंकि भ्रूण व्यवहार्यता और ब्रूड साइज़िंग का आकलन संतान की गिनती और एक सरल गणितीय गणना के माध्यम से अपेक्षाकृत आसानी से किया जाता है, ये प्रयोगशाला या कक्षा में अनुसंधान नौसिखियों के लिए इष्टतम परिचयात्मक प्रयोग हैं। एलिगेंस पशुपालन और आर्थिक लाभ की आसानी उन्हें प्रयोगात्मक जीव विज्ञान कक्षाओं के लिए विशेष रूप से अनुकूल बनाती है। एलिगेंस हसबेंड्री के माध्यम से छात्र मूल्यवान शोध अनुभव प्राप्त करते हैं, विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करना सीखते हैं, और एक विकास ता्मक प्रणाली में जैविक प्रश्न पूछ सकते हैं जिनका उत्तर अपेक्षाकृत कम समय में दिया जा सकता है (इस पेपर में वर्णित प्रोटोकॉल के साथ लगभग 5 दिन)।
भ्रूण की व्यवहार्यता परख के लिए संतान की गिनती का समय बहुत महत्वपूर्ण है। 20 डिग्री सेल्सियस पर, भ्रूणजनन में लगभग 16 घंटे लगते हैं, और प्रजनन रूप से परिपक्व वयस्क एल 1 लार्वा के रूप में अंडे सेने के लगभग 60 घंटे बाद अंडे देना शुरू करते हैं। जैसा कि जीवन चक्र तेजी से होता है, उचित खिड़की के भीतर संतति की गिनती करना महत्वपूर्ण है, जिससे भ्रूण को बाहर निकलने के लिए पर्याप्त समय मिल सके, लेकिन इससे पहले कि संतान स्वयं अंडे देना शुरू करे। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि तापमान के आधार पर विकास अवधि भिन्न होती है। 15-16 डिग्री सेल्सियस की तुलना में 24-25 डिग्री सेल्सियस पर विकास लगभग 2.1 गुना तेज है, और 15-16 डिग्री सेल्सियस13 की तुलना में 20 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 1.3 गुना तेज है। इस प्रोटोकॉल में, हम अनुशंसा करते हैं कि वयस्कों को एक ताजा प्लेट पर रखने के 48 घंटे बाद गिनती होती है। यह समय सीमा सुनिश्चित करती है कि जंगली प्रकार के विकास वाले सभी भ्रूणों के पास हैच करने के लिए पर्याप्त समय है (>16 घंटे), लेकिन प्रजनन क्षमता के बिंदु तक उम्र नहीं है। 20 डिग्री सेल्सियस से कम तापमान पर किए गए परीक्षणों को भ्रूण से बाहर निकलने के लिए विस्तारित (4 दिनों के लिए जानवरों को स्थानांतरित करने) की आवश्यकता हो सकती है और हैच संतान को लार्वा चरणों तक पहुंचने की आवश्यकता हो सकती है जो एमवाईओबी प्लेटों (एल 3-एल 4 चरणों) पर बैक्टीरिया के बीच निरीक्षण करना आसान है।
भ्रूण की व्यवहार्यता परख और ब्रूड साइज़िंग की एक सीमा यह है कि विशिष्ट विकास प्रक्रिया जो परेशान है वह आसानी से स्पष्ट नहीं है। हालांकि, इन प्रारंभिक परखों को साइटोलॉजिकल तकनीकों के साथ पालन किया जा सकता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि कौन सी प्रक्रिया प्रभावित है। उदाहरण के लिए, 4′,6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल (डीएपीआई) धुंधला होने के बाद गोनाड को छोड़ने के लिए वयस्क कीड़े का विच्छेदन और जर्मलाइन के भीतर डीएनए आकृति विज्ञान का सावधानीपूर्वक विश्लेषण यह प्रकट कर सकता है कि क्या मायोटिक प्रक्रियाएं बाधित हैं। इसके अलावा, भ्रूण के डीएपीआई धुंधला होने से पता चल सकता है कि भ्रूणजनन किस चरण में गिरफ्तार होता है।
निष्कर्ष में, हमने उत्पादित भ्रूणों की संख्या (ब्रूड) और विभिन्न सी एलिगेंस उत्परिवर्ती के लिए व्यवहार्य भ्रूण के प्रतिशत को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है। इस परख का उपयोग स्व-निषेचित हेर्मैफ्रोडाइट्स और नर / हेर्मैफ्रोडाइट क्रॉस दोनों के लिए किया जा सकता है। एलिगेंस के छोटे जीवन चक्र के साथ, यह प्रोटोकॉल 1 सप्ताह से भी कम समय में पूरा किया जा सकता है। भ्रूण व्यवहार्यता परख और ब्रूड आकार का उपयोग अर्धसूत्रीविभाजन, निषेचन, या भ्रूण के विकास में शामिल जीन के पहले विश्लेषण के रूप में किया जा सकता है, और अधिक उन्नत शोधकर्ताओं और अनुसंधान नौसिखियों (स्नातक और प्रथम वर्ष के स्नातक छात्रों) के लिए उपयुक्त प्रोटोकॉल हैं।
The authors have nothing to disclose.
जारामिलो-लैम्बर्ट प्रयोगशाला में काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान एनआईजीएमएस आर 35 जीएम 142524 द्वारा समर्थित है। एलिगेंस उपभेदों को केनोरहाब्डिस जेनेटिक्स सेंटर द्वारा प्रदान किया गया था, जिसे राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, पी 40 ओडी 010440 द्वारा वित्त पोषित किया गया है। चित्र 1 डी Biorender.com का उपयोग करके बनाया गया था।
Materials | |||
35 mm Petri dishes | Tritech research | T3501 | Semi-stackable, non-vented. |
Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For MYOB |
Bacto-Peptone | Gibco | 211677 | For MYOB |
Cholestrol | Sigma | C8503 | For MYOB |
Sodium Chloride | J.T. Baker | FW 58.440 | For MYOB |
Trizma Base | Sigma | T1503 | For MYOB |
Trizma hydrochloride | Sigma | T3253 | For MYOB |
Strains | |||
C. elegans wild type strain | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | |
Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
him-5(e1490) | Caenorhabditis Genetics Center | DR466 | |
spo-11(ok79) | Caenorhabditis Genetics Center | AV106 | |
Equipment/software | |||
Differential cell counter | Fischer Scientific | 02-670-12 | |
MicroSoft Excel or Prism | MicroSoft or GraphPad | For recording and creating graphical representations of data. | |
platinum wire | Tritech research | PT9901 | For making worm picks. 99.5% Platinum, 0.5% Iridium. This comes as 3 ft/pack, which is sufficient for making 36 worm picks (~1 inch platinum wire per pick). |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | Diascopic base with focus mount, integrated LED module, power cord, 6.7x to 50x Zoom range [WD 115 mm], Widefield Eyepiece C-15x/17 (Note: equivalent stereomicroscopes are available from other manufacturers.) |
worm pick handle | Tritech research | TWPH1 | For making worm picks. Mount ~1 in platinum wire into worm pick handle. Alternatively, worm picks can be made by mounting platinum wire in a glass Pasteur pipette. |