Her presenterer vi en generell metode for å bestemme embryonal levedyktighet og totalt antall embryoer produsert (brød) ved hjelp av modellorganismen C. elegans.
Caenorhabditis elegans er en utmerket modellorganisme for studier av meiose, befruktning og embryonal utvikling. C. elegans eksisterer som selvgjødslende hermafroditter, som produserer store brød av avkom – når hanner er til stede, kan de produsere enda større brød av kryssavkom. Feil i meiose, befruktning og embryogenese kan raskt vurderes som fenotyper av sterilitet, redusert fruktbarhet eller embryonal dødelighet. Denne artikkelen beskriver en metode for å bestemme embryonal levedyktighet og brødstørrelse i C. elegans. Vi demonstrerer hvordan du setter opp denne analysen ved å plukke en orm på en individuell Modified Youngren’s, Only Bacto-peptone (MYOB) plate, etablere riktig tidsramme for å telle levedyktige avkom og ikke-levedyktige embryoer, og forklare hvordan du nøyaktig teller levende ormprøver. Denne teknikken kan brukes til å bestemme levedyktigheten i selvgjødslende hermafroditter, samt kryssbefruktning ved parringspar. Disse relativt enkle eksperimentene er lett adoptable for nye forskere, for eksempel studenter og førsteårsstudenter.
Seksuell reproduksjon i eukaryote organismer krever produksjon av funksjonelle gameter som fusjonerer for å danne et embryo gjennom prosessen med befruktning. Maternelle og faderlige kjønnsceller, egg (egg) og sæd er opprettet gjennom spesialiserte celledeling og differensieringsprosesser av meiose og gametogenese1. Meiose starter med en enkelt diploid celle og slutter med dannelsen av datterceller som inneholder halvparten av antall kromosomer av den opprinnelige foreldrecellen. Fra reduksjon av ploidi til stokking av genetisk materiale via uavhengig utvalg og crossover-rekombinasjon, tjener meiose flere viktige funksjoner1. Feil innen meiose kan resultere i aneuploidi, der det er for mange eller for få kromosomer i en gamete. Forekomster av aneuploidi har enorm innvirkning på menneskers helse, da kromosomale ubalanser er en viktig årsak til spontanaborter og utviklingsforstyrrelser som Downs syndrom og Edwards syndrom2.
Befruktning er prosessen der moder- og faderlige gameter smelter sammen for å generere en ny organisme3. Gamete-gametegjenkjenning forenkles av proteiner på gameteoverflaten3. Feil med kjønnscellekompatibilitet fører til infertilitet da sæd- og eggfusjon ikke kan fortsette. Fusjonen av sæd med en oocyt utløser en rekke hendelser som fører til riktig dannelse av et aktivt embryo som kan begynne utviklingsreisen fra et encellet embryo til en fullt funksjonell flercellet organisme via mitotiske divisjoner4. Gjennom embryogenese må molekylære hendelser som regulerer utviklingen være tett regulert og nøyaktig tidsbestemt for å muliggjøre riktig vekst av organismen5. Riktig cellulær differensiering under tidlig utvikling er avgjørende når organismen overgår fra et pluripotent embryo til en fullverdig organisme. På grunn av kompleksiteten i disse hendelsene, kan forstyrrelser føre til utviklingsdefekter som resulterer i embryonal dødelighet.
Caenorhabditis elegans er en utmerket modellorganisme for å studere meiose, befruktning og embryonal utvikling. C. elegans er en gjennomsiktig nematode som har to kjønn, menn og hermafroditter. C. elegans hermafroditter, som er i stand til selvbefruktning, er det dominerende kjønn 6,7. Hermafrodittgonaden produserer først sæd under fjerde larvestadium (L4), som lagres i spermatheca. Ved overgangen L4 til voksen alder bytter kimlinjen til å produsere oocytter, som deretter befruktes via den lagrede sæden. Hanner, som oppstår i hermafroditter med en hastighet på mindre enn 0,2%, produserer bare sæd og kan parre seg med hermafroditter. Ved kryssbefruktning utkonkurrerer mannlige sædceller hermafrodittsæd i befruktningen av oocytter8. Dette muliggjør relativt enkelt vedlikehold av homozygote mutanter gjennom selvbefruktende bestander og for genetiske manipulasjoner gjennom genetiske kryss. De to kjønnene tillater studier som undersøker forskjeller mellom meiose i mannlige og kvinnelige kimlinjer. Videre, på grunn av den gjennomsiktige naturen til C. elegans og eggene, kan prosessene for meiose, gametogenese, befruktning og embryogenese studeres i levende, intakte dyr ved hjelp av fluorescensavbildningsteknikker.
Når man analyserer nye mutasjoner i gener som kan spille en rolle i meiose, befruktning og / eller embryonal utvikling i C. elegans, er et avgjørende første skritt å bestemme embryonal levedyktighet og brødstørrelse siden feil i disse prosessene ofte fører til en feil eller reduksjon i produksjonen av levedyktig avkom. Dette papiret beskriver en protokoll for å vurdere fruktbarhet, embryonal levedyktighet og brødstørrelse fra enten selvbefruktende hermafroditter eller kryss mellom hermafroditter og hanner. Selv om denne klassiske analysen har blitt brukt i mange C. elegans-studier , tilbyr vi en standardisert protokoll for oppsett og nøyaktig kvantifisering. I denne protokollen isoleres individuelle ormer eller mannlige / hermafrodittpar for å tillate parring og avkomproduksjon. Avkomproduksjon og levedyktighet observeres over en rekke dager for å bestemme antall levedyktige avkom og ikke-levedyktige embryoer. Ved avslutningen av forsøket analyseres individuelle brød for å beregne embryonal levedyktighetsprosent og total brødstørrelse.
Forplantning av seksuelle reproduserende arter krever dannelse av haploide gameter (dvs. egg og sæd) gjennom meiose, som deretter forenes ved befruktning, gjenoppretter det diploide kromosomnummeret og initierer embryonal utvikling. Feil i noen av disse prosessene kan føre til infertilitet, embryonal dødelighet og / eller fødselsskader. C. elegans er et kraftig modellsystem for å studere seksuell reproduksjon. Effektene av genmutasjoner eller genuttrykksfall (f.eks. RNA-interferens) kan vurderes relativt raskt og enkelt ved hjelp av embryonale levedyktighets- og brødstørrelsesanalyser beskrevet ovenfor. Vi har brukt disse metodene for initial karakterisering av gener involvert i meiotisk kromosomsegregering og befruktning/eggaktivering10,11,12. En observert reduksjon i embryonal levedyktighet eller brødstørrelse indikerer en forstyrrelse i meiose, gametogenese, befruktning eller embryogenese.
Siden embryonal levedyktighet og yngelstørrelse vurderes relativt enkelt gjennom telling av avkom og en enkel matematisk beregning, er dette optimale introduksjonseksperimenter for nybegynnere enten i laboratoriet eller klasserommet. Den enkle C. elegans husdyrhold og økonomiske fordeler gjør dem spesielt egnet til eksperimentelle biologi klasser. Studentene får verdifull forskningserfaring gjennom C. elegans husdyrhold, lærer å bruke dissekerende mikroskop, og kan stille biologiske spørsmål i et utviklingssystem som kan besvares på relativt kort tid (ca. 5 dager med protokollen beskrevet i denne artikkelen).
Tidspunktet for antall avkom er svært viktig for embryonale levedyktighetsanalyser. Ved 20 °C tar embryogenesen ca. 16 timer, og reproduktivt modne voksne begynner å legge egg ca. 60 timer etter klekking som L1-larver. Siden livssyklusen er rask, er det viktig å telle avkom innenfor riktig vindu, noe som gir tilstrekkelig tid for embryoer å klekke, men før avkommet selv begynner å legge egg. Det er også viktig å merke seg at vekstperioder varierer avhengig av temperatur. Veksten er ca. 2,1 ganger raskere ved 24-25 °C enn ved 15-16 °C, og ca. 1,3 ganger raskere ved 20 °C enn ved 15-16 °C13. I denne protokollen anbefaler vi at tellingen skjer 48 timer etter at de voksne er plassert på en ny tallerken. Denne tidsrammen sikrer at alle embryoer med villtypeutvikling har tilstrekkelig tid til å klekkes (>16 timer), men ikke eldes til reproduksjonsevnen. Analyser utført ved temperaturer lavere enn 20 °C må kanskje forlenges (overføringsdyr i 4 dager) for at embryoer skal klekkes og for klekket avkom for å nå larvestadier som er lettere å observere blant bakteriene på MYOB-platene (L3-L4 stadier).
En begrensning for embryonale levedyktighetsanalyser og brødstørrelse er at den spesifikke utviklingsprosessen som forstyrres, ikke er lett synlig. Imidlertid kan disse innledende analysene følges opp med cytologiske teknikker for å bestemme hvilken prosess som påvirkes. For eksempel kan disseksjon av de voksne ormene for å frigjøre gonaden etterfulgt av 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) farging og nøye analyse av DNA-morfologi i kimlinjen avsløre om meiotiske prosesser forstyrres. I tillegg kan DAPI-farging av embryoer avsløre på hvilket stadium embryogenesearrestasjoner.
Avslutningsvis har vi beskrevet en protokoll for å analysere antall produserte embryoer (brød) og prosentandelen embryoer som er levedyktige for ulike C. elegans mutanter. Denne analysen kan brukes til både selvbefruktende hermafroditter og for mannlige / hermafrodittkryss. Med den korte livssyklusen til C. elegans kan denne protokollen fullføres på mindre enn 1 uke. Embryonale levedyktighetsanalyser og brødstørrelser kan brukes som første analyser av gener involvert i meiose, befruktning eller embryonal utvikling, og er passende protokoller for mer avanserte forskere og forskningsnybegynnere (både studenter og førsteårsstudenter).
The authors have nothing to disclose.
Arbeid i Jaramillo-Lambert-laboratoriet støttes av National Institutes of Health NIGMS R35GM142524. Alle C. elegans-stammer ble levert av Caenorhabditis Genetics Center, som er finansiert av National Institutes of Health, P40 OD010440. Figur 1D ble opprettet ved hjelp av Biorender.com.
Materials | |||
35 mm Petri dishes | Tritech research | T3501 | Semi-stackable, non-vented. |
Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For MYOB |
Bacto-Peptone | Gibco | 211677 | For MYOB |
Cholestrol | Sigma | C8503 | For MYOB |
Sodium Chloride | J.T. Baker | FW 58.440 | For MYOB |
Trizma Base | Sigma | T1503 | For MYOB |
Trizma hydrochloride | Sigma | T3253 | For MYOB |
Strains | |||
C. elegans wild type strain | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | |
Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
him-5(e1490) | Caenorhabditis Genetics Center | DR466 | |
spo-11(ok79) | Caenorhabditis Genetics Center | AV106 | |
Equipment/software | |||
Differential cell counter | Fischer Scientific | 02-670-12 | |
MicroSoft Excel or Prism | MicroSoft or GraphPad | For recording and creating graphical representations of data. | |
platinum wire | Tritech research | PT9901 | For making worm picks. 99.5% Platinum, 0.5% Iridium. This comes as 3 ft/pack, which is sufficient for making 36 worm picks (~1 inch platinum wire per pick). |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | Diascopic base with focus mount, integrated LED module, power cord, 6.7x to 50x Zoom range [WD 115 mm], Widefield Eyepiece C-15x/17 (Note: equivalent stereomicroscopes are available from other manufacturers.) |
worm pick handle | Tritech research | TWPH1 | For making worm picks. Mount ~1 in platinum wire into worm pick handle. Alternatively, worm picks can be made by mounting platinum wire in a glass Pasteur pipette. |