Her presenterer vi en protokoll for optimalisert korrelativ lyselektronmikroskopi basert på endogen, fluorescerende merking som et verktøy for å undersøke lokalisering av sjeldne proteiner i forhold til cellulær ultrastruktur. Kraften i denne tilnærmingen er demonstrert ved ultrastrukturell lokalisering av endogen LC3 i sultede celler uten Bafilomycin-behandling.
Visualisering av autofagiske organeller på ultrastrukturelt nivå ved elektronmikroskopi (EM) er avgjørende for å etablere sin identitet og avsløre detaljer som er viktige for å forstå den autofagiske prosessen. Imidlertid mangler EM-metoder ofte molekylær informasjon, noe som hindrer korrelasjonen mellom ultrastrukturell informasjon oppnådd av EM til fluorescensmikroskopibasert lokalisering av spesifikke autofagiproteiner. Videre hemmer sjeldenheten av autofagosomer i uendrede cellulære forhold undersøkelse av EM, noe som krever høy forstørrelse, og gir dermed et begrenset synsfelt.
Som svar på begge utfordringene ble en korrelativ lyselektronmikroskopi (CLEM) -metode basert på fluorescerende merking anvendt for å korrelere en vanlig autofagosomal markør, LC3, til EM-ultrastruktur. Metoden ble brukt til raskt å screene celler i fluorescensmikroskopi for LC3-merking i kombinasjon med andre relevante markører. Deretter ble de underliggende ultrastrukturelle egenskapene til utvalgte LC3-merkede flekker identifisert av CLEM. Metoden ble brukt på sultede celler uten å tilsette hemmere av lysosomal surgjøring.
Under disse forholdene ble LC3 funnet hovedsakelig på autofagosomer og sjelden i autolysosomer, hvor LC3 raskt nedbrytes. Disse dataene viser både gjennomførbarheten og sensitiviteten til denne tilnærmingen, og viser at CLEM kan brukes til å gi ultrastrukturell innsikt i LC3-mediert autofagi under opprinnelige forhold – uten medikamentell behandling eller genetiske endringer. Samlet sett presenterer denne metoden et verdifullt verktøy for ultrastrukturelle lokaliseringsstudier av autofagiproteiner og andre knappe antigener ved å bygge bro mellom lysmikroskopi og EM-data.
Autofagi er en nøkkelprosess for rensing og resirkulering av cytoplasmatiske proteiner og organeller. Prosessen med makro-autofagi (heretter kalt autofagi) involverer dannelsen av dobbeltmembranorganeller, autofagosomer, som gjør det mulig for celler å omslutte cytoplasmatiske molekyler og organeller for lysosomal nedbrytning. Autofagi forekommer på basalnivå i de fleste celler og oppreguleres som respons på cellulære forhold, som sult eller cellulær stress. Autofagi forekommer enten på en substratspesifikk måte, rettet mot spesifikke strukturer eller proteiner for nedbrytning, eller som en ikke-selektiv bulkprosess som omfatter deler av cytosolen. I selektiv autofagi dannes autofagosomer ved konjugering av proteiner i Atg8-familien (mikrotubuliassosierte proteiner 1A/B lettkjede 3A/B/C [LC3] og GABARAPs) til membraner avledet fra resirkulering av endosomer, Golgi, og/eller endoplasmatisk retikulum (ER)1. LC3 gjenkjenner autofagisk last i cytosolen direkte eller via selektive autofagiadaptere som P62/SQSTM. Nye autofagiske membraner kan deretter konjugeres til LC3, utvide seg og smelte sammen for å danne en fullført dobbeltmembran som omslutter lasten kalt autofagosomet. Autofagosomet modnes og smelter til slutt sammen med et endosom eller lysosom, hvoretter den autofagiske lasten og adapterne brytes ned2.
Studier av autofagosomdannelse, modning og fusjon benytter ofte lysmikroskopiteknologier. Fluorescensmikroskopi av LC3 brukes vanligvis til å vurdere antall og cellulær lokalisering av autofagosomer under forskjellige forhold. Videre, ved å koble LC3 til pH-sensitiv GFP og pH-stabil RFP i en såkalt tandemprobe, kan den totale fluksen av autofagi måles i levende celler som en funksjon av GFP-fluorescenstap3. Disse tilnærmingene er verdifulle verktøy for forskere for å forstå autofagiens rolle og mekanisme under forskjellige forhold. Et annet uvurderlig verktøy er elektronmikroskopi (EM), som avslører ultrastrukturen til autofagiske organeller på forskjellige stadier av autofagi 4,5,6,7,8. Til dags dato er EM fortsatt den valgte metoden for å identifisere de nøyaktige stadiene av autofagosomdannelse ved å diskriminere forskjellige autofagiske membraner ved morfologi: fagofor (dobbeltmembran ikke helt lukket), autofagosom (lukket dobbeltmembran rundt cytosolisk last) og autolysosom ([delvis] tap av den indre autofagiske membranen). Morfologi uten molekylær informasjon kan imidlertid være utsatt for feilidentifikasjon eller tvetydighet. Immuno-EM er den mest omfattende metoden for samtidig molekylær karakterisering og morfologisk klassifisering av autofagiske organeller. For eksempel tillater immungullmerking av LC3 på tinte kryoseksjoner ultrastrukturell lokalisering av LC3 og presis identifisering av LC3-merkede organeller9.
En ulempe med EM er det lille synsfeltet som følger med den høye forstørrelsen som kreves for å observere den fine ultrastrukturen av autofagiske membraner og, når det gjelder immuno-EM, for å finne etiketten som markerer proteinet av interesse. På grunn av deres knapphet og lave proteinnivåer, hemmer dette generelt den kvantitative EM-analysen av autofagosomer. For å øke antall autofagosomer, blir celler ofte sultet og behandlet med Bafilomycin A1 (BafA1), en hemmer av lysosomal forsuring og nedbrytning. Uten BafA1-behandling er søket etter autofagosomer ved EM tidkrevende, på grunn av mangelen på disse organellene. Metoden som presenteres i dette manuskriptet løser dette problemet gjennom fluorescerende merking og avbildning av endogent LC3 på tinte kryoseksjoner i et fluorescensmikroskop før videre forberedelse til EM. De fluorescerende bildene styrer deretter søket etter LC3-merkede strukturer i EM. Etter innsamling er EM-bilder korrelert med fluorescensbildene for å legge til molekylær informasjon – tilstedeværelsen av LC3 – til cellens ultrastruktur. Denne “on-section CLEM”-metoden øker i stor grad evnen til å finne LC3-merkede strukturer, spesielt under ubehandlede forhold, for senere identifisering og klassifisering av EM.
Denne metoden ble brukt på sultet hepatoblastom-avledet HEPG210-celler for å finne autofagosomer i uendrede (dvs. ingen BafA1 ble brukt) forhold. Relativt få fluorescerende puncta (mindre enn en per celleprofil i en 90 nm seksjon) ble funnet, noe som er i samsvar med den høye omsetningen av LC311. Denne sparsomheten av LC3-puncta understreket verdien av CLEM; Ved å velge regioner med flere fluorescerende puncta for avbildning i EM, ble LC3-positive organeller funnet og karakterisert på en mye mer effektiv måte enn gjennom konvensjonell immun-EM. Dette viste at flertallet av LC3-positive organeller var autofagosomer, som definert av deres morfologi, som er i motsetning til resultatene oppnådd i BafA1-behandlede celler, hvor autolysosomer er vanligere9. Disse dataene viser at med CLEM, kan autofagi studeres på ultrastrukturelt nivå uten å måtte hemme autofagisk strømning.
Metoden som presenteres her utnytter nylige fremskritt innen kryoseksjonsbasert CLEM på seksjonen – den høye følsomheten til IF-merking og nøyaktig (<100 nm feil) korrelasjon mellom FM og EM14,24. Dette resulterer i en metode med følsomhet for fluorescerende etikettknappe, endogene proteiner og evnen til å legge dette med høy presisjon til EM-ultrastrukturen. Dermed unngår denne metoden behovet for (over) ekspresjon av eksogent merkede proteiner og bruk av mindre følsomme EM-etiketter. Gjennomførbarheten av metoden er vist ved eksempler på CLEM på endogen LC3 i sultede celler, uten bruk av lysosomale hemmere.
Tinte kryoseksjoner oppnådd med Tokuyasu-metoden er ideelle prøver for immun-EM, da de i motsetning til harpiksseksjoner er gjennomtrengelige for antistoffer. Kombinert med milde fikserings- og kontrasteringsprosedyrer, gir dette generelt suveren merkeeffektivitet i forhold til andre metoder uten at det går ut over den detaljerte ultrastrukturen, og visualiserer cellemembraner på en utmerket måte 12,25,26. Videre er kryoseksjoner svært kompatible med fluorescensmikroskopi, noe som gjør dem til verdifulle substrater for CLEM. Både klassisk immungullmerking og CLEM på kryoseksjoner har gitt banebrytende innsikt i å forstå subcellulær organisasjon 14,27,28,29,30.
For tiden blir anvendelser av CLEM på tinte kryoseksjoner stadig mer utbredt, som et resultat av kontinuerlig utvikling og optimalisering 14,20,24,31,32,33,34 som har forbedret kvaliteten, anvendeligheten og nøyaktigheten av tilnærmingen. Nå, ved nøyaktig korrelasjon av store IF- og EM-bildefliser, letter teknikken screening for ultrastrukturen til fluorescerende merkede endogene cellulære komponenter 14,32,33. Dette er en fordel i forhold til klassisk immuno-EM, hvor søket etter gullmerkede strukturer vanligvis krever høy forstørrelse og derfor er mer arbeidskrevende og tidkrevende. Det er av denne grunn at lokalisering av LC3 til ultrastrukturen har stor nytte av CLEM. LC3-positive organeller er vanlige når autofagisk clearance er blokkert (dvs. når celler behandles med BafA1 eller pH-hevende midler), mens autofagiske organeller raskt ryddes i uendrede eller sultede celler, noe som resulterer i svært lave stabile nivåer. Under slike forhold kan det være utfordrende å finne LC3-merkede organeller ved hjelp av klassisk immun-EM, og CLEM gir en klar fordel.
Tidligere ble CLEM på harpiksseksjoner brukt i studier ved bruk av ektopisk uttrykk av LC3-GFP eller en LC3-GFP-RFP tandemsonde 35,36,37,38,39. I disse studiene ble fluorescensavbildning utført før embedding eller direkte i akrylharpiksseksjon40, og prøver ble deretter screenet av EM. Det er flere fordeler med harpiksinnebygging; Den autofagosomale ultrastrukturen er generelt godt bevart, spesielt hvis materialet er høytrykksfrosset40. Videre er kontrasten av tungmetallfarget harpiksinnebygd materiale generelt mer uttalt enn for uranylfargede kryoseksjoner. Harpiks-innebygde seksjoner er kompatible med volumetriske EM-metoder, for eksempel array-tomografi, FIB-SEM eller seriell blokkeringsflate SEM, mens kryoseksjoner ikke er det. I tilnærminger som utfører avbildning før innebygging, er levende celleavbildning et alternativ41 som ikke er tilgjengelig i CLEM på kryoseksjoner. Den viktigste fordelen med CLEM på kryoseksjoner over disse alternativene er det høye IF-signalet, noe som muliggjør immunlokalisering av sjeldne proteiner uten behov for membranpermeabilisering eller overekspresjon. Dette unngår potensiell membranekstraksjon, overekspresjonsartefakter42 og genetisk modifisering av motivet, som kombinert med muligheten til å korrelere store områder i IF og EM, gjør det til et utmerket verktøy for å studere LC3 og autofagi.
Her viste anvendelsen av CLEM på seksjonen til sultede HEPG2-celler at LC3 overveiende lokalisert til strukturer identifisert som autofagosomer. I tillegg ble det funnet noen få svakt fluorescerende flekker i autolysosomer. Dette står i direkte kontrast til celler behandlet med BafA19 og reflekterer den raske nedbrytningen av autofagosomale proteiner når autofagosomet smelter sammen med lysosomer. Samlet sett viste dataene at CLEM av tinte kryoseksjoner kan gi innsikt i LC3-mediert autofagi under opprinnelige forhold. Dataene fremhever også følsomheten til teknologien, siden LC3 ble oppdaget selv i autolysosomer som bare inneholder lave nivåer av intakte LC3-epitoper. Videre anvendelse av denne teknikken ved avbildning av LC3 i forskjellige modeller og forhold vil forbedre vår forståelse av autofagi og andre LC3-medierte biologiske prosesser, som LC3-assosiert fagocytose eller konjugering av ATG8 til enkeltmembraner.
Utover autofagi kan CLEM på snitt brukes på andre sjeldne hendelser eller strukturer, som celledeling, infeksjon, sjeldne celletyper i vev, kinetokorer, primære flimmerhår eller celletypespesifikke organeller. Effektiv screening for emnet av interesse av IF kan i stor grad lette den ultrastrukturelle studien av disse sjeldenhetene. Videre ble det vist14 at teknikken kan brukes til å lokalisere proteiner på en mer sensitiv måte enn klassisk immun-EM. Justering av fikseringslengden kan ytterligere forlenge denne følsomheten, noe som muliggjør ultrastrukturell lokalisering av svært lite rikelig eller dårlig antigene proteiner. Endelig letter CLEM-metoden på seksjonen raskt utvalg av et kvantitativt antall organeller, noe som letter en mer robust analyse av den ultrastrukturelle fordelingen av et gitt protein.
CLEM på kryoseksjoner krever utstyr og ekspertise for kryoseksjonering. I grupper med tilgang til disse verktøyene (f.eks. kryomikrotomer), er implementeringen av CLEM på seksjonen enkel og krever bare tilgjengeligheten av et automatisert bredfeltmikroskop, et oppsett de fleste laboratorier har tilgang til. Videre er metoden tilgjengelig i EM-anlegg over hele verden. Siden CLEM på seksjon kombinerer anvendelse av etablerte IF- og EM-metoder, er metoden lett tilpasset og kan kombineres med for eksempel tomografi 20,33,43, seriesnittvolum EM av et begrenset antall seksjoner 44, eller superoppløsningsmikroskopi 45. Denne allsidigheten av metoden støtter applikasjoner til et bredt spekter av biologiske spørsmål.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker våre kolleger ved Senter for molekylær medisin ved University Medical Center Utrecht for fruktbare diskusjoner og tilbakemeldinger. Vi takker tidligere og nåværende kolleger fra Klumperman-laboratoriet for å gjøre kontinuerlige forbedringer i våre mikroskopiteknologier. EM-infrastrukturen som brukes til dette arbeidet er en del av forskningsprogrammet National Roadmap for Large-Scale Research Infrastructure (NEMI) finansiert av det nederlandske forskningsrådet (NWO), prosjektnummer 184.034.014 til JK.
Chemicals and reagents | |||
Antibody donkey anti-mouse Alexa Fluor 488 | Life Technologies | #A21202 | use 1:250 |
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Life Technologies | A#10042 | use 1:250 |
Antibody mouse anti-LC3 | Cosmo Bio | CTB-LC3-2-IC | use 1:100 |
Antibody rabbit anti-LAMP1 | Cell Signaling | 9091 | use 1:250 |
Bovine serum Albumin, fraction V | Sigma-Aldrich | A-9647 | |
BSA-c | Aurion | 900.099 | |
BSA-conjugated gold | Cell Microscopy Core, UMC Utrecht | BSAG 5 nm | |
Water-free Chloroform | Merck | 1.02447.0500 | |
DAPI | Invitrogen | 10184322 | Use at end concentration of 10 µg/ml |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
Fish-skin Gelatin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
Food-grade gelatin | Merck | G1890 | |
Formvar, Vinylec E | SPI | 02492-RA | |
Gluteraldehyde | Serva | 23115.01 | See CAUTION note |
Glycerol | Boom | MBAK 7044.1000 | |
Glycine | Merck | 1042010250 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Methylcellulose, 25 centipoises | Sigma-Aldrich | M-6385 | |
MgSO4 | Riedel-de Haen | 12142 | |
Na2HPO4 (PB component A) | Merck | 106580-0500 | |
NaBH4 | Merck | 806373 | |
NaH2PO4 (PB component B) | Merck | 106346 | |
NH4OH | Sigma-Aldrich | 221228-0025 | |
Oxalic acid | Merck | 100495 | |
Paraformaldehyde prills | Sigma-Aldrich | 441244 | See CAUTION note |
PIPES | Merck | 110220 | |
Protein-A conjugated gold | Cell Microscopy Core, UMC Utrecht | PAG 5, 10, 15 or 20 nm | |
Sucrose D(+) | VWR | 27483294 | |
Uranyl acetate | SPI | 020624-AB | See CAUTION note |
Tools and consumables | |||
Pick-up loop | Electron Microscopy Sciences | 70944 | |
Filter paper, qualitative, medium-fast | LLG | 6.242 668 | |
Finder grids | Ted Pella | G100F1 | |
Grids | Cell Microscopy Core, UMC Utrecht | CU 100 mesh | |
Microscopes | |||
Leica Thunder widefield microscope | Leica | Components: 100x, 1.47 NA TIRF objective; Photometrics prime 95B sCMOS camera; LAS X software; | |
Leica UC7 ultracryomicrotome | Leica | ||
Tecnai T12 | FEI | Components: Veleta VEL-FEI-TEC12-TEM camera; SerialEM software | |
Software | |||
ec-CLEM in icy | open source | Paul-Gilloteaux et al., 2017 | |
Fiji | open source | Schindelin et al., 2012 | |
IMOD | open source | Mastronarde et al., 2017 | |
Photoshop | Adobe | ||
SerialEM | open source | Mastronarde et al., 2018 |