Preparazione di matrici decellularizzate 3D da muscolo scheletrico fetale di topo per coltura cellulare

Summary

In questo lavoro, un protocollo di decellularizzazione è stato ottimizzato per ottenere matrici decellularizzate del muscolo scheletrico fetale del topo. I mioblasti C2C12 possono colonizzare queste matrici, proliferare e differenziarsi. Questo modello in vitro può essere utilizzato per studiare il comportamento cellulare nel contesto di malattie del muscolo scheletrico come le distrofie muscolari.

Abstract

La matrice extracellulare (ECM) svolge un ruolo cruciale nel fornire supporto strutturale per le cellule e trasmettere segnali importanti per vari processi cellulari. I modelli di coltura cellulare bidimensionale (2D) semplificano eccessivamente le complesse interazioni tra cellule e ECM, poiché la mancanza di un supporto tridimensionale completo (3D) può alterare il comportamento cellulare, rendendoli inadeguati per la comprensione dei processi in vivo . Le carenze nella composizione della ECM e nelle interazioni cellula-ECM sono importanti contributori a una varietà di malattie diverse.

Un esempio è la distrofia muscolare congenita LAMA2 (LAMA2-CMD), dove l'assenza o la riduzione della laminina funzionale 211 e 221 può portare a grave ipotonia, rilevabile alla nascita o subito dopo. Lavori precedenti che utilizzano un modello murino della malattia suggeriscono che la sua insorgenza si verifica durante la miogenesi fetale. Il presente studio mirava a sviluppare un modello 3D in vitro che permettesse lo studio delle interazioni tra cellule muscolari e ECM muscolare fetale, imitando il microambiente nativo. Questo protocollo utilizza muscoli profondi della schiena sezionati da feti di topo E18.5, trattati con un tampone ipotonico, un detergente anionico e DNasi. Le matrici decellularizzate risultanti (dECM) hanno mantenuto tutte le proteine ECM testate (laminina α2, laminine totali, fibronectina, collagene I e collagene IV) rispetto al tessuto nativo.

Quando i mioblasti C2C12 sono stati seminati sopra questi dECM, sono penetrati e hanno colonizzato i dECM, che hanno supportato la loro proliferazione e differenziazione. Inoltre, le cellule C2C12 hanno prodotto proteine ECM, contribuendo al rimodellamento della loro nicchia all'interno delle dECM. L'istituzione di questa piattaforma in vitro fornisce un nuovo approccio promettente per svelare i processi coinvolti nell'insorgenza di LAMA2-CMD e ha il potenziale per essere adattato ad altre malattie del muscolo scheletrico in cui le carenze nella comunicazione tra la ECM e le cellule muscolari scheletriche contribuiscono alla progressione della malattia.

Introduction

La matrice extracellulare (ECM) è un costituente importante dei tessuti, che rappresenta la loro componente non cellulare. Questa struttura tridimensionale (3D) non solo fornisce supporto fisico per le cellule, ma svolge anche un ruolo cruciale nei processi biochimici coinvolti nello sviluppo degli organismi¹. La formazione di una ECM tessuto-specifica avviene durante lo sviluppo, come risultato delle complesse interazioni tra le cellule e le loro nicchie, influenzate da vari stimoli intra ed extracellulari. L'ECM è una struttura altamente dinamica che subisce riarrangiamenti chimici e meccanici in modo temporale-spaziale e influisce direttamen....

Protocol

Tutte le metodologie descritte sono state approvate dal Comitato per il benessere degli animali (ORBEA) della Facoltà di Scienze dell'Università di Lisbona e dalla Direção Geral de Veterinária (DGAV; rif. 0421/000/000/2022) e sono conformi alla Direttiva Europea 2010/63/UE.

1. Preparazione di tamponi e reagenti di decellularizzazione

NOTA: Tutte le soluzioni utilizzate durante il protocollo di decellularizzazione devono essere sterilizzate in autoclave e conservate per un massimo di 3 mesi, salvo diversa indicazione.

1. Preparare 10x soluzione salina tamponata con fosfato (10x PBS) aggiung....

Results

L'obiettivo del protocollo di decellularizzazione è quello di produrre dECM che assomiglino molto alla composizione del tessuto nativo. Per determinare l'efficacia del processo di decellularizzazione, sono stati impiegati vari metodi, tra cui l'esame della morfologia dei tessuti, la misurazione dei livelli di DNA, la colorazione per F-actina e l'analisi dei componenti chiave della ECM utilizzando l'immunoistochimica e le tecniche di western blotting. In particolare, sono stati analizzati cinque principali componenti ECM .......

Discussion

La ECM è una complessa rete di macromolecole che è presente in tutti i tessuti e svolge un ruolo cruciale nella regolazione del comportamento e della funzione cellulare². L'ECM agisce come un'impalcatura fisica a cui le cellule possono attaccarsi e fornisce segnali che modulano attivamente i processi cellulari come proliferazione, motilità, differenziazione e apoptosi. Pertanto, una corretta formazione e mantenimento della ECM è essenziale sia per lo sviluppo che per l'omeostasi^1.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piastra per coltura cellulare a 12 pozzetti, piatta, TC, sterile	Abdos Labware	P21021
4′,6-diamidino-2-fenilindolo dicloridrato	Merck	D8417
4– 20% Mini-PROTEAN TGX Gel prefabbricato	Bio-Rad	4561093
Piastra per coltura cellulare a 48 pozzetti, piatta, TC, sterile	Abdos Labware	P21023
Piastra per coltura cellulare a 96 pozzetti, piatta, TC, sterile	Abdos Labware	P21024
Albumina sierica bovina, frazione V	NZYtech
BX60 microscopio a fluorescenza	Olympus
Cryostat CM1860 UV	Leica
Ditiotreitolo	ThermoFisher	R0862
DMEM alto glucosio con glutammina stabile con piruvato di sodio	Biowest	L0103-500
DNase I	PanReac AppliChem	A3778
DNeasy Blood & Kit di tessuti	Qiagen	69506
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)	Merck	108418
Siero fetale bovino	Biowest	S1560-500
Pipetta per trasferimento di puntali fini	ThermoFisher	15387823
Siero di capra	Biowest	S2000-100
Hera Guard Flow Cabinet	Heraeus
Heracell 150 CO2 Incubatore	Thermo Scientific
HiMark Proteina precolorata Standard	Invitrogen
Siero di cavallo, origine neozelandese	Gibco	16050122
HRP-α- IgG di coniglio	abcam ab205718
HRP-α- IgG di ratto	abcam	ab205720
HRP-α- Topo IgG	abcam	ab205719
ImageJ v. 1.53t
Verde metile	Sigma-Aldrich	67060
MM400 Lissore tissutale	Retsch
NanoDrop ND-1000 Spettrofotometro	ThermoFisher
Paraformaldeide, 16% p/v aq. soln., senza metanolo	Alfa Aesar	043368-9M
Penicillina-Streptomicina (100x)	GRiSP	GTC05.0100
Falloidina Alexa 488	Thermo Fisher Sci.	A12379
Piastra Petri in polistirene 60x15mm con prese d'aria (sterile)	Greiner Bio-One	628161
Qubit dsDNA HS kit	Thermo Scientific	Q32851
Qubit™ 3 Fluorimetro	Invitrogen	15387293
S6E Zoom Stereomicroscopio	Leica
Sodium Dodecyl Sulfate	Merck	11667289001
SuperFrost Vetrini di adesione Plus	Thermo Scientific	631-9483
SuperSignal West Pico PLUS Substrato chemiluminescente	Thermo Scientific	15626144
TCS SPE microscopio confocale	Leica
Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥ 99%	VWR Chemicals	28811.295
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
Trypan Blue Solution, 0,4%	Gibco	15250061
Tripsina-EDTA (0,05%) in DPBS (1X)	GRiSP	GTC02.0100
TWEEN 20 (50% Solution)	ThermoFisher	3005
WesternBright PVDF-CL membrane roll (0,22µ m)	Advansta	L-08024-001
α-Collagene I	abcam	ab21286
α-Collagene IV	Millipore	AB756P
α-Collagene IV	Santa Cruz Biotechnology	sc-398655
α-Fibronectina	Sigma	F-3648
α-Laminin α 2	Sigma	L-0663
&alfa;-MHC	D.S.H.B.	MF20
α-Mouse Alexa 488	Sonde molecolari	A11017
α-Mouse Alexa 568	Sonde molecolari	A11019
α-pan-Laminin	Sigma	L- 9393
α-fosfo-istone 3	Merk Millipore	06-570
α-Rabbit Alexa 568	Sonde	molecolariA21069
α-Sonde	molecolari	A11070
α-Rat Alexa 488	Sonde molecolari	A11006