Framställning av 3D-decellulariserade matriser från fostermusklosträgg för cellodling
Summary
I detta arbete optimerades ett decellulariseringsprotokoll för att erhålla decellulariserade matriser av fostrets musskelettmuskulatur. C2C12-myoblaster kan kolonisera dessa matriser, föröka sig och differentiera. Denna in vitro-modell kan användas för att studera cellbeteende i samband med skelettmuskelsjukdomar som muskeldystrofier.
Abstract
Den extracellulära matrisen (ECM) spelar en avgörande roll för att ge strukturellt stöd för celler och förmedla signaler som är viktiga för olika cellulära processer. Tvådimensionella (2D) cellodlingsmodeller förenklar de komplexa interaktionerna mellan celler och ECM, eftersom bristen på ett komplett tredimensionellt (3D) stöd kan förändra cellbeteendet, vilket gör dem otillräckliga för att förstå in vivo-processer . Brister i ECM-sammansättning och cell-ECM-interaktioner är viktiga bidragsgivare till en mängd olika sjukdomar.
Ett exempel är LAMA2-kongenital muskeldystrofi (LAMA2-CMD), där frånvaro eller reduktion av funktionellt laminin 211 och 221 kan leda till svår hypotoni, detekterbar vid eller strax efter födseln. Tidigare arbete med en musmodell av sjukdomen tyder på att dess uppkomst sker under fostermyogenesen. Den aktuella studien syftade till att utveckla en 3D in vitro-modell som möjliggör studier av interaktionerna mellan muskelceller och fostermuskelns ECM, efterlikna den ursprungliga mikromiljön. Detta protokoll använder djupa ryggmuskler dissekerade från E18.5-musfoster, behandlade med en hypotonisk buffert, ett anjoniskt tvättmedel och DNase. De resulterande decellulariserade matriserna (dECM) behöll alla testade ECM-proteiner (laminin α2, totala lamininer, fibronektin, kollagen I och kollagen IV) jämfört med den ursprungliga vävnaden.
När C2C12-myoblaster såddes ovanpå dessa dECM penetrerade de och koloniserade dECM, vilket stödde deras spridning och differentiering. Dessutom producerade C2C12-cellerna ECM-proteiner, vilket bidrog till ombyggnaden av deras nisch inom dECM. Etableringen av denna in vitro-plattform ger ett nytt lovande tillvägagångssätt för att avslöja de processer som är involverade i uppkomsten av LAMA2-CMD, och har potential att anpassas till andra skelettmuskelsjukdomar där brister i kommunikationen mellan ECM och skelettmuskelceller bidrar till sjukdomsprogression.
Introduction
Den extracellulära matrisen (ECM) är en viktig beståndsdel i vävnader, som representerar deras icke-cellulära komponent. Denna tredimensionella (3D) struktur ger inte bara fysiskt stöd för celler utan spelar också en avgörande roll i de biokemiska processer som är involverade i utvecklingen av organismer1. Bildandet av en vävnadsspecifik ECM sker under utveckling, som ett resultat av de komplexa interaktionerna mellan celler och deras nischer, påverkade av olika intra- och extracellulära stimuli. ECM är en mycket dynamisk struktur som genomgår kemiska och mekaniska omarrangemang på ett tidsmässigt-rumsligt sätt och direkt påverkar cellens öde2. En av de mest anmärkningsvärda egenskaperna hos ECM är dess funktionella mångfald, eftersom varje vävnads ECM visar en unik kombination av molekyler som ger olika topologier och egenskaper som är skräddarsydda för cellerna den innehåller1.
ECM-signalering och stöd är avgörande för utveckling och homeostas, och när det störs kan det leda till flera patologiska tillstånd 3,4. Ett exempel är LAMA2-bristfällig medfödd dystrofi (LAMA2-CMD), som är den vanligaste formen av medfödd muskeldystrofi. LAMA2-genen kodar för laminin α2-kedjan, som finns i laminin 211 och laminin 221, och när den muteras kan den leda till LAMA2-CMD5. Laminin 211 är den huvudsakliga isoformen som finns i basalmembranet som omger skelettmuskelfibrer. När laminin 211 är onormalt eller frånvarande störs länken mellan basalmembranet och muskelcellerna, vilket leder till sjukdomsuppkomsten6. Patienter med LAMA2-CMD uppvisar en mild till svår fenotyp beroende på typen av mutation i LAMA2-genen.
När funktionen hos laminin α2-proteinet påverkas kan patienter uppleva svår muskelhypotoni vid födseln och utveckla kronisk inflammation, fibros och muskelatrofi, vilket leder till minskad livslängd. Hittills har inga riktade behandlingar utvecklats och terapeutiska metoder är begränsade till att lindra symtomen på sjukdomen7. Därför är det avgörande att förstå de underliggande molekylära mekanismerna som är involverade i uppkomsten av denna sjukdom för att utveckla lämpliga terapeutiska strategier 6,8. Tidigare arbete med dyW-musen 9, en modell för LAMA2-CMD, tyder på att sjukdomsuppkomsten börjar i livmodern, särskilt under fostermyogenes10. En bättre förståelse för hur fostrets myogenesdefekt uppstår skulle vara en spelväxlare för att generera nya terapeutiska metoder för LAMA2-CMD.
In vitro-system ger en kontrollerad miljö för att studera cell-cell och cell-ECM-interaktioner, men 2D-odlingsmodeller saknar komplexiteten hos inhemska vävnader. Decellularisering av vävnader producerar vävnads- och utvecklingsstadiespecifika acellulära ECM-byggnadsställningar som mer exakt efterliknar den naturliga cellmikromiljön jämfört med 2D-modeller och konstruerade / syntetiska byggnadsställningar. Decellulariserade matriser (dECM) har potential att bevara värdvävnadens molekylära och mekaniska signaler, vilket gör dem till bättre alternativa modeller för att förstå in vivo-processer 11.
Det finns olika tekniker, reagens och förhållanden som kan användas för decellularisering12,13. I denna studie är ett decellulariseringsprotokoll för fostrets mushjärta, beskrivet av Silva et al.14,15, anpassat till fostrets musskelettmuskulatur och visat sig behålla alla testade ECM-komponenter (laminin α2, totala lamininer, fibronektin, kollagen I och kollagen IV). Protokollet innehåller tre steg: celllys genom osmotisk chock (hypotonisk buffert), plasmamembranupplösning och proteindissociation (0,05% natriumdodecylsulfat [SDS]) och enzymatisk förstörelse av DNA (DNase-behandling). Såvitt vi vet är detta det första etablerade protokollet för decellularisering av musfosters skelettmuskulatur.
För att använda detta 3D-in vitro-system för att studera LAMA2-CMD är det avgörande att bibehålla laminin α2-kedjan efter decellularisering. Därför implementerades ett optimeringsprotokoll där olika tvättmedel (SDS och Triton X-100) och koncentrationer (0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2% och 0,5%) testades (data visas inte). Det optimala valet för cellavlägsnande och bevarande av laminin α2-proteinet visade sig vara 0,05% SDS. C2C12-celler, en väletablerad myoblastcellinje16,17, användes för att fröa dECM. Dessa celler invaderar dECM, prolifererar och differentierar inuti dessa byggnadsställningar och syntetiserar nya ECM-proteiner. Den framgångsrika produktionen av denna 3D in vitro-modell erbjuder ett nytt tillvägagångssätt för att förstå de molekylära och cellulära processerna som är involverade i fostermyogenes, uppkomsten av LAMA2-CMD, och kan utvidgas till andra muskelsjukdomar där kommunikationen mellan ECM och skelettmuskelceller störs.
Protocol
Representative Results
Discussion
ECM är ett komplext nätverk av makromolekyler som finns i alla vävnader och spelar en avgörande roll för att reglera cellbeteende och funktion2. ECM fungerar som en fysisk ställning för celler att fästa vid och ger ledtrådar som aktivt modulerar cellulära processer som proliferation, motilitet, differentiering och apoptos. Således är korrekt bildning och underhåll av ECM avgörande för både utveckling och homeostas1.
Medan 2D-cello…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon; kontrakt nr 23049), MATRIHEALTH-projektet och cE3c-enheten som finansierar UIDB/00329/2020. Vi vill tacka vår donator Henrique Meirelles som valde att stödja MATRIHEALTH-projektet. Detta arbete gynnades av infrastrukturen vid naturvetenskapliga fakultetens mikroskopianläggning, en nod i den portugisiska plattformen för bioavbildning (referens PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), och vi tackar Luís Marques för hans hjälp med bildförvärv och bearbetning. Slutligen tackar vi Marta Palma för teknisk support och vår forskargrupp för deras generösa bidrag.
Materials
| 12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21021 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Merck | D8417 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 4561093 | |
| 48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21023 | |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21024 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V | NZYtech | MB04601 | |
| BX60 fluorescence microscope | Olympus | ||
| Cryostat CM1860 UV | Leica | ||
| Dithiothreitol | ThermoFisher | R0862 | |
| DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate | Biowest | L0103-500 | |
| DNase I | PanReac AppliChem | A3778 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | 108418 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1560-500 | |
| Fine tip transfer pipette | ThermoFisher | 15387823 | |
| Goat serum | Biowest | S2000-100 | |
| Hera Guard Flow Cabinet | Heraeus | ||
| Heracell 150 CO2 Incubator | Thermo Scientific | ||
| HiMark Pre-stained Protein Standard | Invitrogen | ||
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050122 | |
| HRP-α- Rabbit IgG | abcam | ab205718 | |
| HRP-α- Rat IgG | abcam | ab205720 | |
| HRP-α-Mouse IgG | abcam | ab205719 | |
| ImageJ v. 1.53t | |||
| Methyl Green | Sigma-Aldrich | 67060 | |
| MM400 Tissue Lyser | Retsch | ||
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 043368-9M | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | GRiSP | GTC05.0100 | |
| Phalloidin Alexa 488 | Thermo Fisher Sci. | A12379 | |
| Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) | Greiner Bio-One | 628161 | |
| Qubit dsDNA HS kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
| Qubit™ 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | |
| S6E Zoom Stereo microscope | Leica | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck | 11667289001 | |
| SuperFrost® Plus adhesion slides | Thermo Scientific | 631-9483 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 15626144 | |
| TCS SPE confocal microscope | Leica | ||
| Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% | VWR Chemicals | 28811.295 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) | GRiSP | GTC02.0100 | |
| TWEEN 20 (50% Solution) | ThermoFisher | 3005 | |
| WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) | Advansta | L-08024-001 | |
| α-Collagen I | abcam | ab21286 | |
| α-Collagen IV | Millipore | AB756P | |
| α-Collagen IV | Santa Cruz Biotechnology | sc-398655 | |
| α-Fibronectin | Sigma | F-3648 | |
| α-Laminin α2 | Sigma | L-0663 | |
| α-MHC | D.S.H.B. | MF20 | |
| α-Mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11017 | |
| α-Mouse Alexa 568 | Molecular Probes | A11019 | |
| α-pan-Laminin | Sigma | L- 9393 | |
| α-phospho-histone 3 | Merk Millipore | 06-570 | |
| α-Rabbit Alexa 568 | Molecular Probes | A21069 | |
| α-Rabbit Alexa 488 | Molecular Probes | A11070 | |
| α-Rat Alexa 488 | Molecular Probes | A11006 |
References
- Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Genetic disorders of the extracellular matrix. Anatomical Record. 303 (6), 1527-1542 (2020).
- Ahmad, K., Shaikh, S., Ahmad, S. S., Lee, E. J., Choi, I. Cross-talk between extracellular matrix and skeletal muscle: implications for myopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 142 (2020).
- Tome, F. M., et al. Congenital muscular dystrophy with merosin deficiency. Comptes Rendus de l’Academie des Sciences. Serie III, Sciences de la Vie. 317 (4), 351-357 (1994).
- Gawlik, K. I., Durbeej, M. Skeletal muscle laminin and MDC1A: pathogenesis and treatment strategies. Skeletal Muscle. 1 (1), 9 (2011).
- van Ry, P. M., et al. ECM-related myopathies and muscular dystrophies: pros and cons of protein therapies. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1519-1536 (2017).
- Gawlik, K. I., Durbeej, M. A family of laminin α2 chain-deficient mouse mutants: advancing the research on LAMA2-CMD. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 59 (2020).
- Kuang, W., et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Partial genetic correction in two mouse models. Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 844-852 (1998).
- Nunes, A. M., et al. Impaired fetal muscle development and JAK-STAT activation mark disease onset and progression in a mouse model for merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 26 (11), 2018-2033 (2017).
- McCrary, M. W., Bousalis, D., Mobini, S., Song, Y. H., Schmidt, C. E. Decellularized tissues as platforms for in vitro modeling of healthy and diseased tissues. Acta Biomaterialia. 111, 1-19 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Philips, C., Terrie, L., Thorrez, L. Decellularized skeletal muscle: A versatile biomaterial in tissue engineering and regenerative medicine. Biomaterials. 283, 121436 (2022).
- Silva, A. C., et al. Comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3D-like platforms for in vitro studies. Journal of Visualized Experiments. (145), e56924 (2019).
- Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Burattini, S., et al. C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. European Journal of Histochemistry. 48 (3), 223-233 (2004).
- Murphy, D. Caesarean section and fostering. Methods in Molecular Biology. 18, 177-178 (1993).
- Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-specific stain methyl green in the fluorescent labeling of embryos. Journal of Visualized Experiments. (99), e52769 (2015).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. -. A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
- Paulsson, M. A.T.S. Biosynthesis, tissue distribution and isolation of laminins. The Laminins. , 1-26 (1994).
- Fedecostante, M., et al. Recellularized native kidney scaffolds as a novel tool in nephrotoxicity screening. Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals. 46 (9), 1338-1350 (2018).
- Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
- Brouki Milan, P., et al. Decellularization and preservation of human skin: A platform for tissue engineering and reconstructive surgery. Methods. 171, 62-67 (2020).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Collagen VI disorders: Insights on form and function in the extracellular matrix and beyond. Matrix Biology. 71, 348-367 (2018).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: a ToF-SIMS study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Renal tissue engineering with decellularized rhesus monkey kidneys: age-related differences. Tissue Engineering. Part A. 17 (23-24), 2891-2901 (2011).
- Ma, X., et al. Development and in vivo validation of tissue-engineered, small-diameter vascular grafts from decellularized aortae of fetal pigs and canine vascular endothelial cells. Journal of Cardiothoracic Surgery. 12 (1), 101 (2017).
- Wu Young, M. Y., et al. Decellularized fetal matrix suppresses fibrotic gene expression and promotes myogenesis in a rat model of volumetric muscle loss. Plastic and Reconstructive Surgery. 146 (3), 552-562 (2020).
