Isolamento e caratterizzazione dei legamenti uterosacrali murini e degli organi del pavimento pelvico
Summary
Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per la dissezione dei legamenti uterosacrali e di altri tessuti del pavimento pelvico, tra cui la cervice, il retto e la vescica nei topi, per espandere lo studio dei tessuti riproduttivi femminili.
Abstract
Il prolasso degli organi pelvici (POP) è una condizione che colpisce l’integrità, la struttura e il supporto meccanico del pavimento pelvico. Gli organi del pavimento pelvico sono supportati da diverse strutture anatomiche, tra cui muscoli, legamenti e fascia pelvica. Il legamento uterosacrale (USL) è una struttura portante critica e la lesione dell’USL comporta un rischio maggiore di sviluppare POP. Il presente protocollo descrive la dissezione delle USL murine e degli organi del pavimento pelvico insieme all’acquisizione di dati unici sulla composizione e la funzione biochimica dell’USL utilizzando la spettroscopia Raman e la valutazione del comportamento meccanico. I topi sono un modello inestimabile per la ricerca preclinica, ma sezionare l’USL murino è un processo difficile e complesso. Questa procedura presenta un approccio per guidare la dissezione dei tessuti del pavimento pelvico murino, incluso l’USL, per consentire valutazioni e caratterizzazioni multiple. Questo lavoro mira ad aiutare la dissezione dei tessuti del pavimento pelvico da parte di scienziati e ingegneri di base, ampliando così l’accessibilità della ricerca sulle condizioni dell’USL e del pavimento pelvico e lo studio preclinico della salute delle donne utilizzando modelli murini.
Introduction
Circa il 50% delle donne è affetto da prolasso degli organi pelvici (POP)1,2. Circa l’11% di queste donne soddisfa i criteri per sottoporsi a riparazione chirurgica, che ha uno scarso tasso di successo (~ 30%)3,4. La POP è caratterizzata dalla discesa di uno o tutti gli organi pelvici (cioè vescica, utero, cervice e retto) dalla loro posizione naturale a causa del fallimento dell’USL e dei muscoli del pavimento pelvico per fornire un supporto adeguato5. Questa condizione comporta disfunzione anatomica e rottura del tessuto connettivo, nonché lesioni neuromuscolari, oltre ai fattori predisponenti 3,6. Il POP è associato a molteplici fattori come età, peso, parità e tipo di parto (cioè nascite vaginali o cesare). Si ritiene che questi fattori influenzino l’integrità meccanica di tutti i tessuti del pavimento pelvico, con la gravidanza e la parità ritenute i principali driver di POP 5,7,8.
I legamenti uterosacrali (USL) sono importanti strutture di supporto per l’utero, la cervice e la vagina e legano la cervice all’osso sacro4. Il danno alle USL mette le donne ad aumentato rischio di sviluppare POP. Si ritiene che la gravidanza e il parto impongano un ulteriore sforzo sull’USL, che potenzialmente induce lesioni e aumenta le possibilità di POP. L’USL è un tessuto complesso composto da cellule muscolari lisce, vasi sanguigni e linfatici distribuiti eterogeneamente lungo il legamento, che può essere diviso in tre sezioni distinte: cervicale, intermedia e sacrale9. L’integrità meccanica dell’USL deriva da componenti della matrice extracellulare (ECM) come collageni, elastina e proteoglicani 5,9,10. Le fibre di collagene di tipo I sono note per essere un importante componente portante dei tessuti legamentosi e sono, quindi, probabilmente coinvolte nel fallimento dell’USL e nel POP11.
C’è una mancanza di conoscenza per quanto riguarda le cause, la prevalenza e gli effetti del POP nelle donne. Lo sviluppo di un modello animale appropriato di POP è necessario per far progredire la nostra comprensione del pavimento pelvico femminile. I topi e gli esseri umani hanno punti di riferimento anatomici simili all’interno del bacino, come gli ureteri, il retto, la vescica, le ovaie e i legamenti rotondi9, nonché punti di intersezione simili dell’USL con l’utero, la cervice e l’osso sacro. Inoltre, i topi offrono facilità di manipolazione genetica e hanno il potenziale per essere un modello facilmente accessibile ed economico per lo studio di POP9.
Questo studio ha sviluppato un metodo per accedere e isolare l’USL e i diversi tessuti del pavimento pelvico da topi nullipari (cioè mai gravidi). Le USL estratte sono state sottoposte a digestione enzimatica (cioè per rimuovere collageni e glicosaminoglicani), testate per determinare la risposta meccanica sotto carico di trazione e valutate per la composizione biochimica in uno studio proof-of-concept. La capacità di isolare i tessuti intatti faciliterà ulteriori caratterizzazioni meccaniche e biochimiche dei componenti del pavimento pelvico, che è un primo passo cruciale verso il miglioramento della nostra comprensione dei rischi di lesioni legati al parto, alla gravidanza e al POP.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’effetto del danno strutturale sui tessuti riproduttivi femminili è poco studiato ed è necessario un modello animale facilmente accessibile per la ricerca POP. Il topo è un modello economico che può imitare gli studi riproduttivi umani16. A causa del crescente interesse per lo studio del sistema riproduttivo femminile, vi è la necessità di metodi che aiutino lo studio di questi tessuti. Per rispondere a questa esigenza, in questo lavoro, viene stabilito un metodo per sezionare e preparare t…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione CU Boulder Summer Underground Research Opportunities Program (UROP) (CB), dalla NSF Graduate Research Fellowship (L.S.), dalla Schmidt Science Fellowship (CL), dall’University of Colorado Research & Innovation Seed Grant Program (premio 2020 a V.F., S.C. e K.C.) e dall’Anschutz Boulder Nexus Seed Grant presso l’Università del Colorado (a V.F. e K.C.). Un riconoscimento speciale va al Dr. Tyler Tuttle per l’aiuto con la progettazione della camera di carico e ai membri del laboratorio Calve per utili discussioni.
Materials
| 11 Blade | Fisher | 3120030 | Removable blade |
| 1x PBS | Fisher | BP399-1 | Diluted from 10x concentration |
| Chondroitinase ABC | Sigma | C3667-10UN | Enzyme |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemical | LS004194 | Enzyme |
| Confocal Microscope | Leica | STELLARIS 5 | Upright configuration |
| Dissection Microscope | Leica | S9E | With camera |
| Dumont #5 Forceps | Fisher | NC9626652 | Thin tip |
| Female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | strain #: 000664 | |
| FemtoTools Micromanipulator | FemtoTools | FT-RS1002 | 100 mN load cell |
| FST Curved Forceps | Fisher | NC9639443 | Curved tip |
| FST Sharp 9 mm Scissors | Fisher | NC9639443 | Dissection scissors |
| Ghost Dye 780 | Tonbo | 13-0865-T500 | Free amine stain |
| Kimwipes | Fisher | 06-666 | Box of 50 wipes |
| OCT | Tissue Tek | 4583 | Used for tissue preservation |
| PDMS | Thermo Fisher | 044764.AK | Follow manufacturer's instructions |
| Petri Dishes 35 mm | Fisher | FB0875711A | Used for dissected tissue |
| Polyglactin 5-0 Suture | Veter.Sut | VS385VL | With needle |
| Renishaw InVia Raman Microscope | Renishaw | PN192(EN)-02-A | With confocal objectives |
| Rocking Platform | VWR | 10127-876 | 2 tier platform |
| Surgical Gloves | Fisher | 52818 | For dissection |
| Sytox | Thermo Fisher | S11381 | Nuclear stain |
| T-pins | Fisher | S99385 | For dissection |
| Transfer Pipets | Fisher | 13-711-7M | For dissection |
| Underpads | Fisher | 22037950 | To cover dissection pad |
Riferimenti
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