マウス子宮仙靭帯と骨盤底器官の分離と特性評価
Summary
この記事では、女性の生殖組織の研究を拡大するために、マウスの子宮頸部、直腸、膀胱を含む子宮仙靭帯およびその他の骨盤底組織を解剖するための詳細なプロトコルを紹介します。
Abstract
骨盤臓器脱(POP)は、骨盤底の完全性、構造、および機械的サポートに影響を与える状態です。骨盤底の臓器は、筋肉、靭帯、骨盤筋膜など、さまざまな解剖学的構造によって支えられています。子宮仙靭帯(USL)は重要な耐荷重構造であり、USLの損傷によりPOPを発症するリスクが高くなります。本プロトコルでは、ラマン分光法を用いたUSL生化学的組成と機能に関する独自のデータの取得、および機械的挙動の評価とともに、マウスUSLと骨盤底器官の解剖について説明します。マウスは前臨床研究にとって非常に貴重なモデルですが、マウスUSLの解剖は困難で複雑なプロセスです。この手順は、USLを含むマウス骨盤底組織の解剖をガイドし、複数の評価と特性評価を可能にするアプローチを提示します。この研究は、基礎科学者やエンジニアによる骨盤底組織の解剖を支援し、USLおよび骨盤底の状態に関する研究や、マウスモデルを使用した女性の健康の前臨床試験へのアクセスを拡大することを目的としています。
Introduction
女性の約50%が骨盤臓器脱(POP)の影響を受けています1,2。これらの女性の約11%は、成功率が低い外科的修復を受けるための基準を満たしています(~30%)3,4。POPは、USLと骨盤底筋が適切なサポートを提供できないために、骨盤内臓器(すなわち、膀胱、子宮、子宮頸部、および直腸)のいずれかまたはすべてが自然な位置から降下することを特徴としています5。この状態は、素因3,6に加えて、解剖学的機能障害および結合組織の破壊、ならびに神経筋損傷を伴う。POPは、年齢、体重、パリティ、分娩タイプ(すなわち、経腟分娩または帝王切開出産)などの複数の要因に関連しています。これらの要因は、すべての骨盤底組織の機械的完全性に影響を与えると考えられており、妊娠と同等性がPOP5,7,8の主な推進力であると考えられています。
子宮仙骨靭帯(USL)は、子宮、子宮頸部、膣の重要な支持構造であり、子宮頸部を仙骨につなぎます4。USLの損傷により、女性はPOPを発症するリスクが高くなります。妊娠と出産はUSLに追加の負担をかけ、怪我を誘発し、POPの可能性を高める可能性があると考えられています。USLは、靭帯に沿って不均一に分布する平滑筋細胞、血管、リンパ管で構成される複雑な組織であり、頸部、中間部、仙骨部の9つの異なるセクションに分けることができます。USLの機械的完全性は、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカンなどの細胞外マトリックス(ECM)成分に由来します5、9、10。I型コラーゲン線維は、靭帯組織の主要な耐荷重引張成分であることが知られているため、USL障害およびPOP11に関与している可能性があります。
女性におけるPOPの原因、有病率、および影響に関する知識が不足しています。POPの適切な動物モデルの開発は、女性の骨盤底の理解を深めるために必要です。マウスとヒトは、尿管、直腸、膀胱、卵巣、丸い靭帯など、骨盤内に同様の解剖学的ランドマークを持っています9、およびUSLと子宮、子宮頸部、仙骨との同様の交点。さらに、マウスは遺伝子操作が容易であり、POP9の研究のための容易にアクセスでき、費用効果の高いモデルになる可能性があります。
この研究では、未経産(つまり、妊娠していない)マウスからUSLとさまざまな骨盤底組織にアクセスして分離する方法を開発しました。抽出したUSLを酵素消化(すなわち、コラーゲンおよびグリコサミノグリカンを除去する)にかけ、引張荷重下での機械的応答を決定するために試験し、概念実証研究において生化学的組成を評価した。無傷の組織を分離する能力は、骨盤底コンポーネントのさらなる機械的および生化学的特性評価を容易にし、これは出産、妊娠、およびPOPに関連する傷害リスクの理解を深めるための重要な第一歩です。
Protocol
Representative Results
Discussion
女性の生殖組織に対する構造的損傷の影響は十分に研究されておらず、POP研究のために簡単にアクセスできる動物モデルが必要です。マウスは、ヒトの生殖研究を模倣できる費用対効果の高いモデルです16。女性の生殖器系の研究への関心が高まっているため、これらの組織の研究を支援する方法が必要です。このニーズに対処するために、この研究では、構造的および機?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、CUボルダーサマーアンダーグラウンドリサーチオポチュニティプログラム(UROP)助成金(CB)、NSF大学院研究フェローシップ(LS)、シュミットサイエンスフェローシップ(C.L.)、コロラド大学リサーチ&イノベーションシードグラントプログラム(V.F.、S.C.、およびK.C.への2020年賞)、およびコロラド大学のアンシュッツボルダーネクサスシードグラント(VFおよびK.C.に)によってサポートされました。ローディングチャンバーの設計を手伝ってくれたタイラー・タトル博士と、有益な議論をしてくれたCalveラボのメンバーに特別な謝辞を送ります。
Materials
| 11 Blade | Fisher | 3120030 | Removable blade |
| 1x PBS | Fisher | BP399-1 | Diluted from 10x concentration |
| Chondroitinase ABC | Sigma | C3667-10UN | Enzyme |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemical | LS004194 | Enzyme |
| Confocal Microscope | Leica | STELLARIS 5 | Upright configuration |
| Dissection Microscope | Leica | S9E | With camera |
| Dumont #5 Forceps | Fisher | NC9626652 | Thin tip |
| Female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | strain #: 000664 | |
| FemtoTools Micromanipulator | FemtoTools | FT-RS1002 | 100 mN load cell |
| FST Curved Forceps | Fisher | NC9639443 | Curved tip |
| FST Sharp 9 mm Scissors | Fisher | NC9639443 | Dissection scissors |
| Ghost Dye 780 | Tonbo | 13-0865-T500 | Free amine stain |
| Kimwipes | Fisher | 06-666 | Box of 50 wipes |
| OCT | Tissue Tek | 4583 | Used for tissue preservation |
| PDMS | Thermo Fisher | 044764.AK | Follow manufacturer's instructions |
| Petri Dishes 35 mm | Fisher | FB0875711A | Used for dissected tissue |
| Polyglactin 5-0 Suture | Veter.Sut | VS385VL | With needle |
| Renishaw InVia Raman Microscope | Renishaw | PN192(EN)-02-A | With confocal objectives |
| Rocking Platform | VWR | 10127-876 | 2 tier platform |
| Surgical Gloves | Fisher | 52818 | For dissection |
| Sytox | Thermo Fisher | S11381 | Nuclear stain |
| T-pins | Fisher | S99385 | For dissection |
| Transfer Pipets | Fisher | 13-711-7M | For dissection |
| Underpads | Fisher | 22037950 | To cover dissection pad |
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