Isolering og karakterisering av murine uterosacral leddbånd og bekkenbunnsorganer

Summary

Denne artikkelen presenterer en detaljert protokoll for dissekering av uterosacral leddbånd og andre bekkenbunnsvev, inkludert livmorhalsen, endetarmen og blæren hos mus, for å utvide studien av kvinnelige reproduktive vev.

Abstract

Pelvic organ prolaps (POP) er en tilstand som påvirker integriteten, strukturen og mekanisk støtte av bekkenbunnen. Organene i bekkenbunnen støttes av forskjellige anatomiske strukturer, inkludert muskler, leddbånd og bekkenfascia. Uterosacral ligament (USL) er en kritisk bærende struktur, og skade på USL resulterer i en høyere risiko for å utvikle POP. Denne protokollen beskriver disseksjon av murine USL og bekkenbunnsorganene sammen med innsamling av unike data om USL biokjemiske sammensetning og funksjon ved hjelp av Raman-spektroskopi og evaluering av mekanisk oppførsel. Mus er en uvurderlig modell for preklinisk forskning, men dissekering av murine USL er en vanskelig og intrikat prosess. Denne prosedyren presenterer en tilnærming for å veilede disseksjonen av murine bekkenbunnsvev, inkludert USL, for å muliggjøre flere vurderinger og karakterisering. Dette arbeidet tar sikte på å hjelpe disseksjon av bekkenbunnsvev av grunnleggende forskere og ingeniører, og dermed utvide tilgjengeligheten til forskning på USL og bekkenbunnsforhold og den prekliniske studien av kvinners helse ved hjelp av musemodeller.

Introduction

Omtrent 50% av kvinnene er rammet av bekkenorganprolaps (POP)^1,2. Omtrent 11% av disse kvinnene passer kriteriene for å gjennomgå kirurgisk reparasjon, som har en dårlig suksessrate (~ 30%)^3,4. POP er preget av nedstigningen av noen eller alle bekkenorganene (dvs. blære, livmor, livmorhals og endetarm) fra deres naturlige posisjon på grunn av svikt i USL og bekkenbunnsmusklene for å gi tilstrekkelig støtte⁵. Denne tilstanden innebærer anatomisk dysfunksjon og forstyrrelse av bindevevet, samt nevromuskulær skade, i tillegg til predisponerende faktorer ^3,6. POP er forbundet med flere faktorer som alder, vekt, paritet og leveringstype (dvs. vaginale eller keiserlige fødsler). Disse faktorene antas å påvirke den mekaniske integriteten til alle bekkenbunnsvevene, med graviditet og paritet antatt å være de viktigste driverne for POP ^5,7,8.

Uterosacral ligaments (USLs) er viktige støttestrukturer for livmor, livmorhals og vagina og binder livmorhalsen til sakrummet⁴. Skader på USL setter kvinner i økt risiko for å utvikle POP. Det antas at graviditet og fødsel påfører USL ekstra belastning, noe som potensielt induserer skade og øker sjansene for POP. USL er et komplekst vev sammensatt av glatte muskelceller, blodkar og lymfe fordelt heterogent langs ligamentet, som kan deles inn i tre forskjellige seksjoner: livmorhalskreft, mellomliggende og sakral region⁹. Den mekaniske integriteten til USL er avledet fra ekstracellulære matrikskomponenter (ECM) som kollagen, elastin og proteoglykaner ^5,9,10. Type I kollagenfibre er kjent for å være en viktig bærende strekkkomponent i ligamentøst vev og er derfor sannsynligvis involvert i USL-svikt og POP¹¹.

Det mangler kunnskap om årsaker, utbredelse og effekter av POP hos kvinner. Utviklingen av en passende dyremodell av POP er nødvendig for å fremme vår forståelse av den kvinnelige bekkenbunnen. Mus og mennesker har lignende anatomiske landemerker i bekkenet, som urinledere, endetarm, blære, eggstokker og runde leddbånd⁹, samt lignende skjæringspunkter i USL med livmor, livmorhals og sakrum. Videre tilbyr mus enkel genetisk manipulasjon og har potensial til å være en lett tilgjengelig, kostnadseffektiv modell for studiet av POP⁹.

Denne studien utviklet en metode for å få tilgang til og isolere USL og de forskjellige bekkenbunnsvevene fra nulliparøse (dvs. aldri gravide) mus. De ekstraherte USLene ble utsatt for enzymatisk fordøyelse (dvs. å fjerne kollagener og glykosaminoglykaner), testet for å bestemme den mekaniske responsen under strekkbelastning, og evaluert for biokjemisk sammensetning i en proof-of-concept-studie. Evnen til å isolere intakte vev vil legge til rette for ytterligere mekaniske og biokjemiske karakteriseringer av bekkenbunnskomponentene, noe som er et viktig første skritt mot å forbedre vår forståelse av skaderisikoen knyttet til fødsel, graviditet og POP.

Protocol

Alle dyreforsøk og prosedyrer ble utført i henhold til protokoll #2705, godkjent av Animal Care and Use Committee ved University of Colorado Boulder. Seks uker gamle kvinnelige C57BL/6J-mus ble brukt til denne studien. Dyrene ble hentet fra en kommersiell kilde (se materialtabell). 1. Dyr forberedelse Avlive dyret etter institusjonelt godkjent metode.MERK: Den foreliggende studien brukte CO 2 -innånding i samsvar med American Veteri…

Representative Results

Hvert trinn i disseksjonen av en villtypemus er detaljert i den tilhørende videoen og figurene relatert til protokollen. For denne studien ble 6 uker gamle kvinnelige C57BL/6J mus brukt (tilleggstabell 1). Tre prøvegrupper med USL behandlet med forskjellige enzymer ble analysert: kontroll (ingen behandling), kollagenasebehandlede og kondroitinasebehandlede grupper. Den glatte muskelen, nerver og lymfe i USL er omgitt av en ECM rik på fibrillære kollagener og glykosaminoglykaner (GAGs)<sup class="xref…

Discussion

Effekten av strukturell skade på kvinnelige reproduktive vev er understudert, og en lett tilgjengelig dyremodell for POP-forskning er nødvendig. Musen er en kostnadseffektiv modell som kan etterligne menneskelige reproduksjonsstudier¹⁶. På grunn av den økende interessen for studiet av det kvinnelige reproduktive systemet, er det behov for metoder som hjelper studiet av disse vevene. For å møte dette behovet er det i dette arbeidet etablert en metode for å dissekere og forberede murine bekke…

Materials

11 Blade	Fisher	3120030	Removable blade
1x PBS	Fisher	BP399-1	Diluted from 10x concentration
Chondroitinase ABC	Sigma	C3667-10UN	Enzyme
Collagenase Type I	Worthington Biochemical	LS004194	Enzyme
Confocal Microscope	Leica	STELLARIS 5	Upright configuration
Dissection Microscope	Leica	S9E	With camera
Dumont #5 Forceps	Fisher	NC9626652	Thin tip
Female C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	strain #: 000664
FemtoTools Micromanipulator	FemtoTools	FT-RS1002	100 mN load cell
FST Curved Forceps	Fisher	NC9639443	Curved tip
FST Sharp 9 mm Scissors	Fisher	NC9639443	Dissection scissors
Ghost Dye 780	Tonbo	13-0865-T500	Free amine stain
Kimwipes	Fisher	06-666	Box of 50 wipes
OCT	Tissue Tek	4583	Used for tissue preservation
PDMS	Thermo Fisher	044764.AK	Follow manufacturer's instructions
Petri Dishes 35 mm	Fisher	FB0875711A	Used for dissected tissue
Polyglactin 5-0 Suture	Veter.Sut	VS385VL	With needle
Renishaw InVia Raman Microscope	Renishaw	PN192(EN)-02-A	With confocal objectives
Rocking Platform	VWR	10127-876	2 tier platform
Surgical Gloves	Fisher	52818	For dissection
Sytox	Thermo Fisher	S11381	Nuclear stain
T-pins	Fisher	S99385	For dissection
Transfer Pipets	Fisher	13-711-7M	For dissection
Underpads	Fisher	22037950	To cover dissection pad