Denne artikkelen presenterer en detaljert protokoll for dissekering av uterosacral leddbånd og andre bekkenbunnsvev, inkludert livmorhalsen, endetarmen og blæren hos mus, for å utvide studien av kvinnelige reproduktive vev.
Pelvic organ prolaps (POP) er en tilstand som påvirker integriteten, strukturen og mekanisk støtte av bekkenbunnen. Organene i bekkenbunnen støttes av forskjellige anatomiske strukturer, inkludert muskler, leddbånd og bekkenfascia. Uterosacral ligament (USL) er en kritisk bærende struktur, og skade på USL resulterer i en høyere risiko for å utvikle POP. Denne protokollen beskriver disseksjon av murine USL og bekkenbunnsorganene sammen med innsamling av unike data om USL biokjemiske sammensetning og funksjon ved hjelp av Raman-spektroskopi og evaluering av mekanisk oppførsel. Mus er en uvurderlig modell for preklinisk forskning, men dissekering av murine USL er en vanskelig og intrikat prosess. Denne prosedyren presenterer en tilnærming for å veilede disseksjonen av murine bekkenbunnsvev, inkludert USL, for å muliggjøre flere vurderinger og karakterisering. Dette arbeidet tar sikte på å hjelpe disseksjon av bekkenbunnsvev av grunnleggende forskere og ingeniører, og dermed utvide tilgjengeligheten til forskning på USL og bekkenbunnsforhold og den prekliniske studien av kvinners helse ved hjelp av musemodeller.
Omtrent 50% av kvinnene er rammet av bekkenorganprolaps (POP)1,2. Omtrent 11% av disse kvinnene passer kriteriene for å gjennomgå kirurgisk reparasjon, som har en dårlig suksessrate (~ 30%)3,4. POP er preget av nedstigningen av noen eller alle bekkenorganene (dvs. blære, livmor, livmorhals og endetarm) fra deres naturlige posisjon på grunn av svikt i USL og bekkenbunnsmusklene for å gi tilstrekkelig støtte5. Denne tilstanden innebærer anatomisk dysfunksjon og forstyrrelse av bindevevet, samt nevromuskulær skade, i tillegg til predisponerende faktorer 3,6. POP er forbundet med flere faktorer som alder, vekt, paritet og leveringstype (dvs. vaginale eller keiserlige fødsler). Disse faktorene antas å påvirke den mekaniske integriteten til alle bekkenbunnsvevene, med graviditet og paritet antatt å være de viktigste driverne for POP 5,7,8.
Uterosacral ligaments (USLs) er viktige støttestrukturer for livmor, livmorhals og vagina og binder livmorhalsen til sakrummet4. Skader på USL setter kvinner i økt risiko for å utvikle POP. Det antas at graviditet og fødsel påfører USL ekstra belastning, noe som potensielt induserer skade og øker sjansene for POP. USL er et komplekst vev sammensatt av glatte muskelceller, blodkar og lymfe fordelt heterogent langs ligamentet, som kan deles inn i tre forskjellige seksjoner: livmorhalskreft, mellomliggende og sakral region9. Den mekaniske integriteten til USL er avledet fra ekstracellulære matrikskomponenter (ECM) som kollagen, elastin og proteoglykaner 5,9,10. Type I kollagenfibre er kjent for å være en viktig bærende strekkkomponent i ligamentøst vev og er derfor sannsynligvis involvert i USL-svikt og POP11.
Det mangler kunnskap om årsaker, utbredelse og effekter av POP hos kvinner. Utviklingen av en passende dyremodell av POP er nødvendig for å fremme vår forståelse av den kvinnelige bekkenbunnen. Mus og mennesker har lignende anatomiske landemerker i bekkenet, som urinledere, endetarm, blære, eggstokker og runde leddbånd9, samt lignende skjæringspunkter i USL med livmor, livmorhals og sakrum. Videre tilbyr mus enkel genetisk manipulasjon og har potensial til å være en lett tilgjengelig, kostnadseffektiv modell for studiet av POP9.
Denne studien utviklet en metode for å få tilgang til og isolere USL og de forskjellige bekkenbunnsvevene fra nulliparøse (dvs. aldri gravide) mus. De ekstraherte USLene ble utsatt for enzymatisk fordøyelse (dvs. å fjerne kollagener og glykosaminoglykaner), testet for å bestemme den mekaniske responsen under strekkbelastning, og evaluert for biokjemisk sammensetning i en proof-of-concept-studie. Evnen til å isolere intakte vev vil legge til rette for ytterligere mekaniske og biokjemiske karakteriseringer av bekkenbunnskomponentene, noe som er et viktig første skritt mot å forbedre vår forståelse av skaderisikoen knyttet til fødsel, graviditet og POP.
Effekten av strukturell skade på kvinnelige reproduktive vev er understudert, og en lett tilgjengelig dyremodell for POP-forskning er nødvendig. Musen er en kostnadseffektiv modell som kan etterligne menneskelige reproduksjonsstudier16. På grunn av den økende interessen for studiet av det kvinnelige reproduktive systemet, er det behov for metoder som hjelper studiet av disse vevene. For å møte dette behovet er det i dette arbeidet etablert en metode for å dissekere og forberede murine bekke…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av CU Boulder Summer Underground Research Opportunities Program (UROP) stipend (CB), NSF Graduate Research Fellowship (LS), Schmidt Science Fellowship (CL), University of Colorado Research & Innovation Seed Grant Program (2020-prisen til VF, SC og KC), og Anschutz Boulder Nexus Seed Grant ved University of Colorado (til VF og KC). Spesiell anerkjennelse går til Dr. Tyler Tuttle for hjelp med lastekammerdesignet, samt Calve-laboratoriemedlemmene for nyttige diskusjoner.
11 Blade | Fisher | 3120030 | Removable blade |
1x PBS | Fisher | BP399-1 | Diluted from 10x concentration |
Chondroitinase ABC | Sigma | C3667-10UN | Enzyme |
Collagenase Type I | Worthington Biochemical | LS004194 | Enzyme |
Confocal Microscope | Leica | STELLARIS 5 | Upright configuration |
Dissection Microscope | Leica | S9E | With camera |
Dumont #5 Forceps | Fisher | NC9626652 | Thin tip |
Female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | strain #: 000664 | |
FemtoTools Micromanipulator | FemtoTools | FT-RS1002 | 100 mN load cell |
FST Curved Forceps | Fisher | NC9639443 | Curved tip |
FST Sharp 9 mm Scissors | Fisher | NC9639443 | Dissection scissors |
Ghost Dye 780 | Tonbo | 13-0865-T500 | Free amine stain |
Kimwipes | Fisher | 06-666 | Box of 50 wipes |
OCT | Tissue Tek | 4583 | Used for tissue preservation |
PDMS | Thermo Fisher | 044764.AK | Follow manufacturer's instructions |
Petri Dishes 35 mm | Fisher | FB0875711A | Used for dissected tissue |
Polyglactin 5-0 Suture | Veter.Sut | VS385VL | With needle |
Renishaw InVia Raman Microscope | Renishaw | PN192(EN)-02-A | With confocal objectives |
Rocking Platform | VWR | 10127-876 | 2 tier platform |
Surgical Gloves | Fisher | 52818 | For dissection |
Sytox | Thermo Fisher | S11381 | Nuclear stain |
T-pins | Fisher | S99385 | For dissection |
Transfer Pipets | Fisher | 13-711-7M | For dissection |
Underpads | Fisher | 22037950 | To cover dissection pad |