Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per la dissezione dei legamenti uterosacrali e di altri tessuti del pavimento pelvico, tra cui la cervice, il retto e la vescica nei topi, per espandere lo studio dei tessuti riproduttivi femminili.
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Articolo metodologico
Isolamento e caratterizzazione dei legamenti uterosacrali murini e degli organi del pavimento pelvico
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il prolasso degli organi pelvici (POP) è una condizione che colpisce l'integrità, la struttura e il supporto meccanico del pavimento pelvico. Gli organi del pavimento pelvico sono supportati da diverse strutture anatomiche, tra cui muscoli, legamenti e fascia pelvica. Il legamento uterosacrale (USL) è una struttura portante critica e la lesione dell'USL comporta un rischio maggiore di sviluppare POP. Il presente protocollo descrive la dissezione delle USL murine e degli organi del pavimento pelvico insieme all'acquisizione di dati unici sulla composizione e la funzione biochimica dell'USL utilizzando la spettroscopia Raman e la valutazione del comportamento meccanico. I topi sono un modello inestimabile per la ricerca preclinica, ma sezionare l'USL murino è un processo difficile e complesso. Questa procedura presenta un approccio per guidare la dissezione dei tessuti del pavimento pelvico murino, incluso l'USL, per consentire valutazioni e caratterizzazioni multiple. Questo lavoro mira ad aiutare la dissezione dei tessuti del pavimento pelvico da parte di scienziati e ingegneri di base, ampliando così l'accessibilità della ricerca sulle condizioni dell'USL e del pavimento pelvico e lo studio preclinico della salute delle donne utilizzando modelli murini.
Introduzione
Circa il 50% delle donne è affetto da prolasso degli organi pelvici (POP)1,2. Circa l'11% di queste donne soddisfa i criteri per sottoporsi a riparazione chirurgica, che ha uno scarso tasso di successo (~ 30%)3,4. La POP è caratterizzata dalla discesa di uno o tutti gli organi pelvici (cioè vescica, utero, cervice e retto) dalla loro posizione naturale a causa del fallimento dell'USL e dei muscoli del pavimento pelvico per fornire un supporto adeguato5. Questa condizione comporta disfunzione anatomica e rottura del tessuto conne....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti e le procedure sugli animali sono stati eseguiti secondo il protocollo # 2705, approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Colorado Boulder. Per il presente studio sono stati utilizzati topi femmina C57BL / 6J di sei settimane. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).
1. Preparazione degli animali
- Eutanasia dell'animale seguendo il metodo approvato istituzionalmente.
NOTA: Il presente studio ha utilizzato l'inalazione di CO 2 in linea con le linee guida dell'American Veterinary Medical Associati....
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Risultati
Ogni passaggio della dissezione di un mouse wild-type è dettagliato nel video associato e nelle figure relative al protocollo. Per questo studio, sono stati utilizzati topi femmina C57BL / 6J di 6 settimane (Tabella supplementare 1). Sono stati analizzati tre gruppi campione con USL trattati con diversi enzimi: gruppi trattati con controllo (nessun trattamento), trattati con collagenasi e condroitinasi. La muscolatura liscia, i nervi e i linfatici dell'USL sono circondati da una ECM ricca di collageni fi.......
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Discussione
L'effetto del danno strutturale sui tessuti riproduttivi femminili è poco studiato ed è necessario un modello animale facilmente accessibile per la ricerca POP. Il topo è un modello economico che può imitare gli studi riproduttivi umani16. A causa del crescente interesse per lo studio del sistema riproduttivo femminile, vi è la necessità di metodi che aiutino lo studio di questi tessuti. Per rispondere a questa esigenza, in questo lavoro, viene stabilito un metodo per sezionare e preparare tessuti.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione CU Boulder Summer Underground Research Opportunities Program (UROP) (CB), dalla NSF Graduate Research Fellowship (L.S.), dalla Schmidt Science Fellowship (CL), dall'University of Colorado Research & Innovation Seed Grant Program (premio 2020 a V.F., S.C. e K.C.) e dall'Anschutz Boulder Nexus Seed Grant presso l'Università del Colorado (a V.F. e K.C.). Un riconoscimento speciale va al Dr. Tyler Tuttle per l'aiuto con la progettazione della camera di carico e ai membri del laboratorio Calve per utili discussioni.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 11 lame | Fisher | 3120030 | Lama rimovibile |
| 1x PBS | Fisher | BP399-1 | Diluito da 10x concentrazione |
| Condroitinasi ABC | Sigma | C3667-10UN | Enzima |
| Collagenasi Tipo I | Worthington Biochimico | LS004194 | enzima |
| Microscopio confocale | Leica | STELLARIS 5 | Configurazione verticale |
| Microscopio di dissezione | Leica | S9E | Con fotocamera |
| Dumont #5 Pinze | Fisher | NC9626652 | Punta sottile |
| Femmina C57BL/6J topi | Jackson Ceppo di laboratorio | #: 000664 | |
| FemtoTools Micromanipolatore | FemtoTools | FT-RS1002 | Cella di carico da 100 mN |
| Pinza curva FST | Fisher | NC9639443 | punta curva |
| FST Sharp 9 mm Forbici | Fisher | NC9639443 | Forbici da dissezione |
| Ghost Dye 780 | Tonbo | 13-0865-T500 | Macchia di ammina libera |
| Kimwipes | Fisher | 06-666 | Scatola da 50 salviette |
| OCT | Tissue Tek | 4583 | Utilizzato per la conservazione dei tessuti |
| PDMS | Thermo Fisher | 044764.AK | Seguire le istruzioni del produttore |
| Piastre di Petri 35 mm | Fisher | FB0875711A | Utilizzato per tessuti sezionati |
| Polyglactin Sutura 5-0 | Veter.Sut | VS385VL | Con ago |
| Renishaw InVia Raman Microscopio | Renishaw | PN192(EN)-02-A | Con obiettivi confocali |
| Piattaforma a dondolo | VWR | 10127-876 | a 2 livelli |
| Guanti chirurgici | Fisher | 52818 | Per dissezione |
| Sytox | Thermo Fisher | S11381 | Colorante nucleare |
| Perni a T | Fisher | S99385 | Per dissezione |
| Pipette di trasferimento | Fisher | 13-711-7M | Per dissezione |
| Sottocuscinetti | Fisher | 22037950 | Per coprire il tampone di dissezione |
Riferimenti
- Maldonado, P. A., Wai, C. Y. Pelvic organ prolapse. Obstetrics and Gynecology Clinics of North America. 43 (1), 15-26 (2016).
- Drewes, P. G., et al. Pelvic organ prolapse in fibulin-5 knockout mice: Pregnancy-in....
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Ristampe e permessi
