Bu makalede, kadın üreme dokularının çalışmasını genişletmek için farelerde uterosakral ligamentlerin ve serviks, rektum ve mesane dahil olmak üzere diğer pelvik taban dokularının diseksiyonu için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.
Pelvik organ prolapsusu (POP), pelvik tabanın bütünlüğünü, yapısını ve mekanik desteğini etkileyen bir durumdur. Pelvik tabandaki organlar kaslar, bağlar ve pelvik fasyalar dahil olmak üzere farklı anatomik yapılar tarafından desteklenir. Uterosakral ligament (USL) kritik bir yük taşıyıcı yapıdır ve USL’nin yaralanması POP gelişme riski daha yüksektir. Bu protokol, murin USL’lerinin ve pelvik taban organlarının diseksiyonunun yanı sıra, Raman spektroskopisi kullanılarak USL biyokimyasal bileşimi ve fonksiyonu hakkında benzersiz verilerin elde edilmesini ve mekanik davranışın değerlendirilmesini açıklamaktadır. Fareler klinik öncesi araştırmalar için paha biçilmez bir modeldir, ancak murin USL’yi diseksiyonu zor ve karmaşık bir süreçtir. Bu prosedür, USL de dahil olmak üzere murin pelvik taban dokularının diseksiyonuna rehberlik etmek için çoklu değerlendirme ve karakterizasyona olanak tanıyan bir yaklaşım sunmaktadır. Bu çalışma, pelvik taban dokularının temel bilim adamları ve mühendisler tarafından diseksiyonuna yardımcı olmayı, böylece USL ve pelvik taban koşulları üzerine yapılan araştırmaların erişilebilirliğini ve fare modellerini kullanarak kadın sağlığının klinik öncesi çalışmasını genişletmeyi amaçlamaktadır.
Kadınların yaklaşık %50’si pelvik organ prolapsusundan (POP) etkilenir1,2. Bu kadınların yaklaşık %11’i, düşük bir başarı oranına (~%30) sahip olan cerrahi onarım kriterlerine uymaktadır 3,4. POP, USL ve pelvik taban kaslarının yeterli desteği sağlayamaması nedeniyle pelvik organların (yani mesane, uterus, serviks ve rektum) herhangi birinin veya tamamının doğal pozisyonlarından inmesi ile karakterizedir5. Bu durum, predispozan faktörlere ek olarak anatomik disfonksiyon ve bağ dokusunun bozulmasının yanı sıra nöromüsküler hasarı da içerir 3,6. POP, yaş, kilo, parite ve doğum şekli (yani vajinal veya sezaryen doğumlar) gibi birçok faktörle ilişkilidir. Bu faktörlerin tüm pelvik taban dokularının mekanik bütünlüğünü etkilediği düşünülmektedir, gebelik ve paritenin POP 5,7,8’in ana itici güçleri olduğu düşünülmektedir.
Uterosakral ligamentler (USL’ler) uterus, serviks ve vajina için önemli destekleyici yapılardır ve serviksi sakrum4’e bağlar. USL’lere verilen hasar, kadınları POP geliştirme riskine sokar. Hamilelik ve doğumun, USL’ye potansiyel olarak yaralanmaya neden olan ve POP şansını artıran ek bir baskı oluşturduğuna inanılmaktadır. USL, ligament boyunca heterojen olarak dağılmış düz kas hücreleri, kan damarları ve lenfatiklerden oluşan karmaşık bir dokudur ve üç ayrı bölüme ayrılabilir: servikal, orta ve sakral bölge9. USL’nin mekanik bütünlüğü, kollajenler, elastin ve proteoglikanlar gibi hücre dışı matriks (ECM) bileşenlerinden türetilir 5,9,10. Tip I kollajen liflerinin, ligamentöz dokuların önemli bir yük taşıyan gerilme bileşeni olduğu bilinmektedir ve bu nedenle muhtemelen USL yetmezliği ve POP11 ile ilgilidir.
Kadınlarda POP’un nedenleri, prevalansı ve etkileri hakkında bilgi eksikliği vardır. Uygun bir POP hayvan modelinin geliştirilmesi, kadın pelvik tabanı hakkındaki anlayışımızı ilerletmek için gereklidir. Fareler ve insanlar, pelvis içinde üreterler, rektum, mesane, yumurtalıklar ve yuvarlak bağlar9 gibi benzer anatomik işaretlere ve USL’nin uterus, serviks ve sakrum ile benzer kesişme noktalarına sahiptir. Ayrıca, fareler genetik manipülasyon kolaylığı sunar ve POP9 çalışması için kolayca erişilebilir, uygun maliyetli bir model olma potansiyeline sahiptir.
Bu çalışma, USL’ye ve farklı pelvik taban dokularına nullipar (yani asla hamile olmayan) farelerden erişmek ve izole etmek için bir yöntem geliştirdi. Ekstrakte edilen USL’ler enzimatik sindirime tabi tutuldu (yani, kollajenleri ve glikozaminoglikanları çıkarmak için), çekme yükü altında mekanik tepkiyi belirlemek için test edildi ve bir kavram kanıtı çalışmasında biyokimyasal bileşim için değerlendirildi. Bozulmamış dokuları izole etme yeteneği, pelvik taban bileşenlerinin daha fazla mekanik ve biyokimyasal karakterizasyonunu kolaylaştıracaktır, bu da doğum, hamilelik ve POP ile ilgili yaralanma riskleri hakkındaki anlayışımızı geliştirmeye yönelik çok önemli bir ilk adımdır.
Yapısal hasarın kadın üreme dokuları üzerindeki etkisi yeterince çalışılmamıştır ve POP araştırması için kolay erişilebilir bir hayvan modeline ihtiyaç vardır. Fare, insan üreme çalışmalarını taklit edebilen uygun maliyetli bir modeldir16. Kadın üreme sisteminin çalışmasına artan ilgi nedeniyle, bu dokuların çalışmasına yardımcı olacak yöntemlere ihtiyaç vardır. Bu ihtiyacı karşılamak için, bu çalışmada, murin pelvik taban dokularının yapısal ve …
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, CU Boulder Yaz Yeraltı Araştırma Fırsatları Programı (UROP) hibesi (C.B.), NSF Lisansüstü Araştırma Bursu (L.S.), Schmidt Bilim Bursu (CL), Colorado Üniversitesi Araştırma ve İnovasyon Tohum Hibe Programı (2020 ödülü V.F., S.C. ve KC) ve Colorado Üniversitesi’ndeki Anschutz Boulder Nexus Tohum Bursu (VF ve K.C.’ye) tarafından desteklenmiştir. Özel teşekkür, yükleme odası tasarımıyla ilgili yardım için Dr. Tyler Tuttle’a ve yararlı tartışmalar için Calve laboratuvarı üyelerine gider.
11 Blade | Fisher | 3120030 | Removable blade |
1x PBS | Fisher | BP399-1 | Diluted from 10x concentration |
Chondroitinase ABC | Sigma | C3667-10UN | Enzyme |
Collagenase Type I | Worthington Biochemical | LS004194 | Enzyme |
Confocal Microscope | Leica | STELLARIS 5 | Upright configuration |
Dissection Microscope | Leica | S9E | With camera |
Dumont #5 Forceps | Fisher | NC9626652 | Thin tip |
Female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | strain #: 000664 | |
FemtoTools Micromanipulator | FemtoTools | FT-RS1002 | 100 mN load cell |
FST Curved Forceps | Fisher | NC9639443 | Curved tip |
FST Sharp 9 mm Scissors | Fisher | NC9639443 | Dissection scissors |
Ghost Dye 780 | Tonbo | 13-0865-T500 | Free amine stain |
Kimwipes | Fisher | 06-666 | Box of 50 wipes |
OCT | Tissue Tek | 4583 | Used for tissue preservation |
PDMS | Thermo Fisher | 044764.AK | Follow manufacturer's instructions |
Petri Dishes 35 mm | Fisher | FB0875711A | Used for dissected tissue |
Polyglactin 5-0 Suture | Veter.Sut | VS385VL | With needle |
Renishaw InVia Raman Microscope | Renishaw | PN192(EN)-02-A | With confocal objectives |
Rocking Platform | VWR | 10127-876 | 2 tier platform |
Surgical Gloves | Fisher | 52818 | For dissection |
Sytox | Thermo Fisher | S11381 | Nuclear stain |
T-pins | Fisher | S99385 | For dissection |
Transfer Pipets | Fisher | 13-711-7M | For dissection |
Underpads | Fisher | 22037950 | To cover dissection pad |