Murin uterosakral ligamentlerin ve pelvik taban organlarının izolasyonu ve karakterizasyonu
Summary
Bu makalede, kadın üreme dokularının çalışmasını genişletmek için farelerde uterosakral ligamentlerin ve serviks, rektum ve mesane dahil olmak üzere diğer pelvik taban dokularının diseksiyonu için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.
Abstract
Pelvik organ prolapsusu (POP), pelvik tabanın bütünlüğünü, yapısını ve mekanik desteğini etkileyen bir durumdur. Pelvik tabandaki organlar kaslar, bağlar ve pelvik fasyalar dahil olmak üzere farklı anatomik yapılar tarafından desteklenir. Uterosakral ligament (USL) kritik bir yük taşıyıcı yapıdır ve USL’nin yaralanması POP gelişme riski daha yüksektir. Bu protokol, murin USL’lerinin ve pelvik taban organlarının diseksiyonunun yanı sıra, Raman spektroskopisi kullanılarak USL biyokimyasal bileşimi ve fonksiyonu hakkında benzersiz verilerin elde edilmesini ve mekanik davranışın değerlendirilmesini açıklamaktadır. Fareler klinik öncesi araştırmalar için paha biçilmez bir modeldir, ancak murin USL’yi diseksiyonu zor ve karmaşık bir süreçtir. Bu prosedür, USL de dahil olmak üzere murin pelvik taban dokularının diseksiyonuna rehberlik etmek için çoklu değerlendirme ve karakterizasyona olanak tanıyan bir yaklaşım sunmaktadır. Bu çalışma, pelvik taban dokularının temel bilim adamları ve mühendisler tarafından diseksiyonuna yardımcı olmayı, böylece USL ve pelvik taban koşulları üzerine yapılan araştırmaların erişilebilirliğini ve fare modellerini kullanarak kadın sağlığının klinik öncesi çalışmasını genişletmeyi amaçlamaktadır.
Introduction
Kadınların yaklaşık %50’si pelvik organ prolapsusundan (POP) etkilenir1,2. Bu kadınların yaklaşık %11’i, düşük bir başarı oranına (~%30) sahip olan cerrahi onarım kriterlerine uymaktadır 3,4. POP, USL ve pelvik taban kaslarının yeterli desteği sağlayamaması nedeniyle pelvik organların (yani mesane, uterus, serviks ve rektum) herhangi birinin veya tamamının doğal pozisyonlarından inmesi ile karakterizedir5. Bu durum, predispozan faktörlere ek olarak anatomik disfonksiyon ve bağ dokusunun bozulmasının yanı sıra nöromüsküler hasarı da içerir 3,6. POP, yaş, kilo, parite ve doğum şekli (yani vajinal veya sezaryen doğumlar) gibi birçok faktörle ilişkilidir. Bu faktörlerin tüm pelvik taban dokularının mekanik bütünlüğünü etkilediği düşünülmektedir, gebelik ve paritenin POP 5,7,8’in ana itici güçleri olduğu düşünülmektedir.
Uterosakral ligamentler (USL’ler) uterus, serviks ve vajina için önemli destekleyici yapılardır ve serviksi sakrum4’e bağlar. USL’lere verilen hasar, kadınları POP geliştirme riskine sokar. Hamilelik ve doğumun, USL’ye potansiyel olarak yaralanmaya neden olan ve POP şansını artıran ek bir baskı oluşturduğuna inanılmaktadır. USL, ligament boyunca heterojen olarak dağılmış düz kas hücreleri, kan damarları ve lenfatiklerden oluşan karmaşık bir dokudur ve üç ayrı bölüme ayrılabilir: servikal, orta ve sakral bölge9. USL’nin mekanik bütünlüğü, kollajenler, elastin ve proteoglikanlar gibi hücre dışı matriks (ECM) bileşenlerinden türetilir 5,9,10. Tip I kollajen liflerinin, ligamentöz dokuların önemli bir yük taşıyan gerilme bileşeni olduğu bilinmektedir ve bu nedenle muhtemelen USL yetmezliği ve POP11 ile ilgilidir.
Kadınlarda POP’un nedenleri, prevalansı ve etkileri hakkında bilgi eksikliği vardır. Uygun bir POP hayvan modelinin geliştirilmesi, kadın pelvik tabanı hakkındaki anlayışımızı ilerletmek için gereklidir. Fareler ve insanlar, pelvis içinde üreterler, rektum, mesane, yumurtalıklar ve yuvarlak bağlar9 gibi benzer anatomik işaretlere ve USL’nin uterus, serviks ve sakrum ile benzer kesişme noktalarına sahiptir. Ayrıca, fareler genetik manipülasyon kolaylığı sunar ve POP9 çalışması için kolayca erişilebilir, uygun maliyetli bir model olma potansiyeline sahiptir.
Bu çalışma, USL’ye ve farklı pelvik taban dokularına nullipar (yani asla hamile olmayan) farelerden erişmek ve izole etmek için bir yöntem geliştirdi. Ekstrakte edilen USL’ler enzimatik sindirime tabi tutuldu (yani, kollajenleri ve glikozaminoglikanları çıkarmak için), çekme yükü altında mekanik tepkiyi belirlemek için test edildi ve bir kavram kanıtı çalışmasında biyokimyasal bileşim için değerlendirildi. Bozulmamış dokuları izole etme yeteneği, pelvik taban bileşenlerinin daha fazla mekanik ve biyokimyasal karakterizasyonunu kolaylaştıracaktır, bu da doğum, hamilelik ve POP ile ilgili yaralanma riskleri hakkındaki anlayışımızı geliştirmeye yönelik çok önemli bir ilk adımdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yapısal hasarın kadın üreme dokuları üzerindeki etkisi yeterince çalışılmamıştır ve POP araştırması için kolay erişilebilir bir hayvan modeline ihtiyaç vardır. Fare, insan üreme çalışmalarını taklit edebilen uygun maliyetli bir modeldir16. Kadın üreme sisteminin çalışmasına artan ilgi nedeniyle, bu dokuların çalışmasına yardımcı olacak yöntemlere ihtiyaç vardır. Bu ihtiyacı karşılamak için, bu çalışmada, murin pelvik taban dokularının yapısal ve …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, CU Boulder Yaz Yeraltı Araştırma Fırsatları Programı (UROP) hibesi (C.B.), NSF Lisansüstü Araştırma Bursu (L.S.), Schmidt Bilim Bursu (CL), Colorado Üniversitesi Araştırma ve İnovasyon Tohum Hibe Programı (2020 ödülü V.F., S.C. ve KC) ve Colorado Üniversitesi’ndeki Anschutz Boulder Nexus Tohum Bursu (VF ve K.C.’ye) tarafından desteklenmiştir. Özel teşekkür, yükleme odası tasarımıyla ilgili yardım için Dr. Tyler Tuttle’a ve yararlı tartışmalar için Calve laboratuvarı üyelerine gider.
Materials
| 11 Blade | Fisher | 3120030 | Removable blade |
| 1x PBS | Fisher | BP399-1 | Diluted from 10x concentration |
| Chondroitinase ABC | Sigma | C3667-10UN | Enzyme |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemical | LS004194 | Enzyme |
| Confocal Microscope | Leica | STELLARIS 5 | Upright configuration |
| Dissection Microscope | Leica | S9E | With camera |
| Dumont #5 Forceps | Fisher | NC9626652 | Thin tip |
| Female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | strain #: 000664 | |
| FemtoTools Micromanipulator | FemtoTools | FT-RS1002 | 100 mN load cell |
| FST Curved Forceps | Fisher | NC9639443 | Curved tip |
| FST Sharp 9 mm Scissors | Fisher | NC9639443 | Dissection scissors |
| Ghost Dye 780 | Tonbo | 13-0865-T500 | Free amine stain |
| Kimwipes | Fisher | 06-666 | Box of 50 wipes |
| OCT | Tissue Tek | 4583 | Used for tissue preservation |
| PDMS | Thermo Fisher | 044764.AK | Follow manufacturer's instructions |
| Petri Dishes 35 mm | Fisher | FB0875711A | Used for dissected tissue |
| Polyglactin 5-0 Suture | Veter.Sut | VS385VL | With needle |
| Renishaw InVia Raman Microscope | Renishaw | PN192(EN)-02-A | With confocal objectives |
| Rocking Platform | VWR | 10127-876 | 2 tier platform |
| Surgical Gloves | Fisher | 52818 | For dissection |
| Sytox | Thermo Fisher | S11381 | Nuclear stain |
| T-pins | Fisher | S99385 | For dissection |
| Transfer Pipets | Fisher | 13-711-7M | For dissection |
| Underpads | Fisher | 22037950 | To cover dissection pad |
Riferimenti
- Maldonado, P. A., Wai, C. Y. Pelvic organ prolapse. Obstetrics and Gynecology Clinics of North America. 43 (1), 15-26 (2016).
- Drewes, P. G., et al. Pelvic organ prolapse in fibulin-5 knockout mice: Pregnancy-induced changes in elastic fiber homeostasis in mouse vagina. American Journal of Pathology. 170 (2), 578-589 (2007).
- Barber, M. D., Maher, C. Epidemiology and outcome assessment of pelvic organ prolapse. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 24 (11), 1783-1790 (2013).
- Becker, W. R., De Vita, R. Biaxial mechanical properties of swine uterosacral and cardinal ligaments. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 14 (3), 549-560 (2015).
- Donaldson, K., Huntington, A., De Vita, R. Mechanics of uterosacral ligaments: Current knowledge, existing gaps, and future directions. Annals of Biomedical Engineering. 49 (8), 1788-1804 (2021).
- Amundsen, C. L., Flynn, B. J., Webster, G. D. Anatomical correction of vaginal vault prolapse by uterosacral ligament fixation in women who also require a pubovaginal sling. Journal of Urology. 169 (5), 1770-1774 (2003).
- Jelovsek, J. E., Maher, C., Barber, M. D. Pelvic organ prolapse. The Lancet. 396 (9566), 1027-1038 (2007).
- Blomquist, J. L., Muñoz, A., Carroll, M., Handa, V. L. Association of delivery mode with pelvic floor disorders after childbirth. Journal of the American Medical Association. 320 (23), 2438-2447 (2018).
- Iwanaga, R., et al. Comparative histology of mouse, rat, and human pelvic ligaments. International Urogynecology Journal. 27 (11), 1697-1704 (2016).
- Zhu, Y. P., et al. Evaluation of extracellular matrix protein expression and apoptosis in the uterosacral ligaments of patients with or without pelvic organ prolapse. International Urogynecology Journal. 32 (8), 2273-2281 (2021).
- Jimenez, J. M., et al. Multiscale mechanical characterization and computational modeling of fibrin gels. bioRxiv. , (2022).
- Fischenich, K. M., et al. Human articular cartilage is orthotropic where microstructure, micromechanics, and chemistry vary with depth and split-line orientation. Osteoarthritis and Cartilage. 28 (10), 1362-1372 (2020).
- Luetkemeyer, C. M., Neu, C. P., Calve, S. A method for defining tissue injury criteria reveals ligament deformation thresholds are multimodal. bioRxiv. , (2023).
- O’Brien, C. M., et al. In vivo Raman spectroscopy for biochemical monitoring of the human cervix throughout pregnancy. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 218 (5), 1-18 (2018).
- Louwagie, E. M., et al. et al. ultrasonic dimensions and parametric solid models of the gravid uterus and cervix. PLoS One. 16 (1), 0242118 (2021).
- Drewes, P. G., et al. Pelvic organ prolapse in fibulin-5 knockout mice. The American Journal of Pathology. 170 (2), 578-589 (2007).
- Rahn, D. D., Ruff, M. D., Brown, S. A., Tibbals, H. F., Word, R. A. Biomechanical properties of the vaginal wall: Effect of pregnancy, elastic fiber deficiency, and pelvic organ prolapse. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 198 (5), 1-6 (2008).
- Roman, S., et al. Evaluating alternative materials for the treatment of stress urinary incontinence and pelvic organ prolapse: A comparison of the in vivo response to meshes implanted in rabbits. Journal of Urology. 196 (1), 261-269 (2016).
- Couri, B. M., Lenis, A. T., Borazjani, A., Paraiso, M. F., Damaser, M. S. Animal models of female pelvic organ prolapse: Lessons learned. Expert Review of Obstetrics & Gynecology. 7 (3), 49 (2012).
- Abramowitch, S. D., Feola, A., Jallah, Z., Moalli, P. A. Tissue mechanics, animal models, and pelvic organ prolapse: A review. European Journal of Obstetrics & Gynecologyand Reproductive Biology. 144, S146-S158 (2009).
- Tan, T., Cholewa, N. M., Case, S. W., De Vita, R. Micro-structural and biaxial creep properties of the swine uterosacral-cardinal ligament complex. Annals of Biomedical Engineering. 44 (11), 3225-3237 (2016).
- Tan, T., et al. Histo-mechanical properties of the swine cardinal and uterosacral ligaments. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 42, 129-137 (2015).
- Baah-Dwomoh, A., Alperin, M., Cook, M., De Vita, R. Mechanical analysis of the uterosacral ligament: Swine vs. human. Annals of Biomedical Engineering. 46 (12), 2036-2047 (2018).
- Vardy, M. D., et al. The effects of hormone replacement on the biomechanical properties of the uterosacral and round ligaments in the monkey model. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 192 (5), 1741-1751 (2005).
- Shahryarinejad, A., Vardy, M. D. Comparison of human to macaque uterosacral-cardinal ligament complex and its relationship to pelvic organ prolapse. Toxicological Pathology. 36 (7), 101 (2008).
- Smith, T. M., Luo, J., Hsu, Y., Ashton-Miller, J., DeLancey, O. L. A novel technique to measure in vivo uterine suspensory ligament stiffness. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 209 (5), 1-7 (2013).
- Vandamme, T. F. Use of rodents as models for human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6 (1), 2-9 (2014).
