جيل من الفئران ذات الضربة القاضية الخاصة بالدهون البنية باستخدام نظام Cre-LoxP و CRISPR-Cas9 والفيروس أحادي التوجيه المرتبط بالغدي
Summary
في هذا البروتوكول ، نصف الإجراءات الفنية لتوليد فئران بالضربة القاضية خاصة بالأنسجة الدهنية البنية (BAT) تستفيد من نظام Cre-LoxP و CRISPR-Cas9 والفيروس المرتبط بالغدي (AAV) أحادي التوجيه (sgRNA). تشمل الخطوات الموصوفة تصميم sgRNAs ، وإعداد جزيئات AAV-sgRNA ، والحقن الدقيق ل AAV في فصوص BAT.
Abstract
الأنسجة الدهنية البنية (BAT) هي مستودع دهني متخصص في تبديد الطاقة يمكن أن يكون أيضا بمثابة عضو الغدد الصماء عن طريق إفراز الجزيئات النشطة بيولوجيا. يعد إنشاء فئران بالضربة القاضية الخاصة ب BAT أحد أكثر الأساليب شيوعا لفهم مساهمة الجين ذي الأهمية في تنظيم الطاقة بوساطة BAT. كانت استراتيجية استهداف الجينات التقليدية التي تستخدم نظام Cre-LoxP هي النهج الرئيسي لتوليد فئران بالضربة القاضية خاصة بالأنسجة. ومع ذلك ، فإن هذا النهج يستغرق وقتا طويلا ومملة. هنا ، نصف بروتوكولا للضربة القاضية السريعة والفعالة لجين مهم في BAT باستخدام نظام Cre-LoxP و CRISPR-Cas9 والفيروس المرتبط بالغدي (AAV) أحادي التوجيه (sgRNA). يقع BAT بين الكتفين في الطبقة العميقة بين العضلات. وبالتالي ، يجب الكشف عن أفضل التقنيات المتاحة من أجل حقن AAV بدقة ومباشرة في BAT داخل المجال البصري. المعالجة الجراحية المناسبة أمر بالغ الأهمية لمنع تلف الأعصاب والأوعية الودية، مثل وريد سولتزر الذي يتصل بالخفافيش المضادة للضرب. لتقليل تلف الأنسجة ، هناك حاجة ماسة لفهم الموقع التشريحي ثلاثي الأبعاد ل BAT والمهارات الجراحية المطلوبة في الخطوات الفنية. يسلط هذا البروتوكول الضوء على الإجراءات الفنية الرئيسية ، بما في ذلك تصميم sgRNAs التي تستهدف الجين محل الاهتمام ، وإعداد جزيئات AAV-sgRNA ، وجراحة الحقن المجهري المباشر ل AAV في كل من فصوص BAT لتوليد الفئران بالضربة القاضية الخاصة ب BAT ، والتي يمكن تطبيقها على نطاق واسع لدراسة الوظائف البيولوجية للجينات في BAT.
Introduction
تتزايد السمنة بمعدل كبير في جميع أنحاء العالم ، مما يؤدي إلى مجموعة واسعة من الأمراض الأيضية1،2،3. الأنسجة الدهنية هي مفتاح هذه الأمراض. النوعان المتميزان وظيفيا من الأنسجة الدهنية الموجودة هما الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT) ، التي تخزن السعرات الحرارية الزائدة ، والأنسجة الدهنية البنية (BAT) والدهون ذات الصلة باللون البيج / البرايت ، والتي تبدد الطاقة من أجل توليد الحرارة. في حين تم الاعتراف BAT لوظيفتها في تبديد الطاقة ، إلا أن لها أيضا وظائف الغدد الصماء عن طريق إنتاج جزيئات نشطة بيولوجيا تنظم عملية التمثيل الغذائي في الأعضاء البعيدة 4,5. أظهرت العديد من الدراسات التي أجريت على القوارض أن زيادة كمية أو نشاط الدهون البنية أو البيج يؤدي إلى زيادة إنفاق الطاقة وتحسين حساسية الأنسولين. في البشر ، الأشخاص الذين يعانون من BAT يمكن اكتشافها لديهم معدل انتشار أقل بكثير من أمراض القلبوالأوعية الدموية 6. وبالتالي ، فإن BAT يحمل إمكانات علاجية ممتازة للعقابيل الأيضية المرتبطة بالسمنة7،8،9.
للتحقيق في علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية لتطور BAT ووظيفتها ولتوضيح الآليات الجزيئية المشاركة في هذه العمليات ، فإن نموذج الماوس المعدل وراثيا الخاص ب BAT هو طريقة الاختيار10. نظام إعادة التركيب Cre-LoxP هو الوسيلة الأكثر استخداما لإنتاج فئران خروج المغلوب الشرطية عن طريق تحرير جينوم الفأر. وقد مكن هذا النظام من تعديل (الإفراط في التعبير أو الضربة القاضية) للجينات ذات الأهمية بطريقة خاصة بالأنسجة / الخلايا11. يمكن استخدامه أيضا لتسمية نوع معين من الخلايا عن طريق التعبير عن جين مراسل فلوري انتقائي.
في الآونة الأخيرة ، تم تطوير نهج نظام Cre-LoxP بشكل أكبر من خلال الجمع بين تقنية CRISPR-Cas9 ونظام الحمض النووي الريبي أحادي التوجيه (sgRNA) المرتبط بالفيروس الغدي (AAV)12. نظام CRISPR-Cas9 هو أداة محددة وفعالة لتحرير الجينات لتعديل أو تنظيم أو استهداف مناطق دقيقة من الجينوم13. يسمح تحرير الجينوم القائم على CRISPR-Cas9 بالتلاعب الجيني السريع للمواقع الجينومية لأنه لا يتطلب إعادة التركيب المتماثل مع ناقل استهداف الجينات. تمكن تقنيات Cre-LoxP و CRISPR-Cas9 و AAV-sgRNA المشتركة الباحثين من فهم وظائف الجينات بشكل أكثر دقة من خلال السماح بالتحقيق في دور الجينات ذات الأهمية في الأوقات المرغوبة في الأنسجة / الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، تقلل هذه التقنيات مجتمعة من الوقت والجهد اللازمين لتوليد الفئران المعدلة وراثيا وتسمح بالتحكم الزمني في نشاط CRISPR-Cas9 لتحرير الجينوم المستحث في الفئران إذا تم استخدام خط Cre المستحث14.
نواقل AAV آمنة وفعالة في أنظمة توصيل الجينات في الجسم الحي. ومع ذلك ، فإن AAVs التي تستهدف الأنسجة الدهنية قد تخلفت عن التطبيقات في الأنسجة الأخرى ، مثل الدماغ والقلب والكبد والعضلات15. نظرا لكفاءة النقل المنخفضة نسبيا والانتحاء مع نواقل النمط المصلي التي تحدث بشكل طبيعي ، لا يزال توصيل الجينات الموجهة ب AAV إلى الأنسجة الدهنية يمثل تحديا15. على مدى السنوات ال 5 الماضية ، نجحنا نحن وآخرون في إنشاء طرق فعالة وطفيفة التوغل لتوصيل الجينات الموجهة ب AAV إلى الأنسجة الدهنية وإنشاء نماذج فأر تسمح لنا بفهم الجينات المشاركة في تنظيم وظيفة BAT16،17،18،19. على سبيل المثال ، باستخدام AAV8 لتوصيل sgRNA الذي يستهدف Alox12 ، والذي يشفر 12-lipoxygenase (12-LOX) ، إلى BAT للفئران Ucp1-Cre / Cas9 ، اكتشفنا أن BAT المنشط ينتج مستقلبات 12-LOX ، وهي حمض 12-hydroxy-eicosapentaenoic (12-HEPE) و 13R ، 14S-dihydroxy docosahexaenoic acid (maresin 2) ، لتنظيم استقلاب الجلوكوز وحل الالتهابات المرتبطة بالسمنة ، على التوالي16 ، 17. هنا ، نقدم بروتوكولا خطوة بخطوة بشأن الإجراءات الفنية ، لا سيما جراحة الحقن المجهري المباشر ل AAV-sgRNA في فصوص BAT ، لتوليد فئران خروج المغلوب الخاصة ب BAT باستخدام نظام Cre-LoxP و CRISPR-Cas9 و AAV-sgRNA المدمج.
Protocol
Representative Results
Discussion
لا تحتوي الطرق المنشورة الحالية لتوصيل الجينات بوساطة AAV إلى BAT بين الكتفين على صور ومقاطع فيديو مفصلة تصف التقنيات الجراحية ونهج الحقن المباشر ل AAV في BAT. في معظم الطرق المنشورة33,34 ، يتم حقن AAV في الأنسجة الدهنية المحيطة ب BAT بين الكتفين بدلا من BAT نفسها. وبالت?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة (NIH) R01DK122808 و R01DK102898 و R01DK132469 (إلى Y.-H.T.) ، وكذلك P30DK036836 (إلى مركز أبحاث السكري التابع لمركز جوسلين للسكري). تم دعم T. T. من قبل زمالة SUNSTAR البحثية (منحة Hiroo Kaneda ، مؤسسة Sunstar ، اليابان) ومنحة جمعية القلب الأمريكية 903968. تم دعم Y. Z. من قبل زمالة Charles A. King Trust. نشكر شون د. كوداني على تفضله بتدقيق المخطوطة.
Materials
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| OPTI-MEM serum-free medium | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma | TR-1003-G | |
| TransIT-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| Recombinant DNA | |||
| lentiCRISPR v2 vector | Addgene | 52961 | |
| pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP | Addgene | 89060 | |
| pMD2.G envelope plasmid | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 packaging plasmid | Addgene | 12260 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| WT-1 cells | Developed in Tseng lab | PMID: 14966273 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Cas9 knockin mice | Jackson Laboratories | 24857 | |
| Ucp1-CRE mice | Jackson Laboratories | 24670 | |
| Others | |||
| Banamine | Patterson | 07-859-1323 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | Model 710 RN Syringe | |
| Hydrogen peroxide solution | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Needle | Hamilton | 32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2 | |
| Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx | Henry Schein | 1273504 | |
| Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx | Henry Schein | 1294522 |
Riferimenti
- Kopelman, P. G. Obesity as a medical problem. Nature. 404 (6778), 635-643 (2000).
- Finkelstein, E. A., et al. Obesity and severe obesity forecasts through 2030. American Journal of Preventive Medicine. 42 (6), 563-570 (2012).
- Craft, S. Insulin resistance and Alzheimer’s disease pathogenesis: Potential mechanisms and implications for treatment. Current Alzheimer Research. 4 (2), 147-152 (2007).
- Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. Brown adipose tissue as a secretory organ. Nature Reviews Endocrinology. 13 (1), 26-35 (2017).
- Scheele, C., Wolfrum, C. Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism. Endocrine Reviews. 41 (1), 53-65 (2020).
- Becher, T., et al. Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health. Nature Medicine. 27 (1), 58-65 (2021).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: Physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).
- Darcy, J., Tseng, Y. H. ComBATing aging-does increased brown adipose tissue activity confer longevity. Geroscience. 41 (3), 285-296 (2019).
- da Silva Xavier, G., Hodson, D. J. Mouse models of peripheral metabolic disease. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 32 (3), 299-315 (2018).
- Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: General principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory Animal Research. 34 (4), 147-159 (2018).
- Wang, D., Zhang, F., Gao, G. CRISPR-based therapeutic genome editing: Strategies and in vivo delivery by AAV vectors. Cell. 181 (1), 136-150 (2020).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Dow, L. E., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33 (4), 390-394 (2015).
- Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: An emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
- Sugimoto, S., et al. Brown adipose tissue-derived MaR2 contributes to cold-induced resolution of inflammation. Nature Metabolism. 4 (6), 775-790 (2022).
- Leiria, L. O., et al. 12-lipoxygenase regulates cold adaptation and glucose metabolism by producing the omega-3 lipid 12-HEPE from brown fat. Cell Metabolism. 30 (4), 768-783 (2019).
- Shamsi, F., et al. FGF6 and FGF9 regulate UCP1 expression independent of brown adipogenesis. Nature Communications. 11, 1421 (2020).
- Romanelli, S. M., et al. BAd-CRISPR: Inducible gene knockout in interscapular brown adipose tissue of adult mice. Journal of Biological Chemistry. 297 (6), 101402 (2021).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9, 5416 (2018).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
- Tseng, Y. H., Kriauciunas, K. M., Kokkotou, E., Kahn, C. R. Differential roles of insulin receptor substrates in brown adipocyte differentiation. Molecular and Cellular Biology. 24 (5), 1918-1929 (2004).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: Sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
- Jarrett, K. E., et al. Somatic genome editing with CRISPR/Cas9 generates and corrects a metabolic disease. Scientific Reports. 7, 44624 (2017).
- Zhang, Y., et al. Optimized RNA-targeting CRISPR/Cas13d technology outperforms shRNA in identifying functional circRNAs. Genome Biology. 22 (1), 41 (2021).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).
- Jimenez, V., et al. In vivo adeno-associated viral vector-mediated genetic engineering of white and brown adipose tissue in adult mice. Diabetes. 62 (12), 4012-4022 (2013).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Huang, W., Queen, N. J., Cao, L. rAAV-mediated gene delivery to adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1950, 389-405 (2019).
- Xue, K., Wu, D., Qiu, Y. Specific and efficient gene knockout and overexpression in mouse interscapular brown adipocytes in vivo. STAR Protocols. 3 (4), 101895 (2022).
