In questo protocollo, descriviamo le procedure tecniche per generare topi knockout specifici per il tessuto adiposo bruno (BAT) sfruttando un sistema combinato di Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e RNA a guida singola (sgRNA) del virus adeno-associato (AAV). I passaggi descritti includono la progettazione degli sgRNA, la preparazione delle particelle AAV-sgRNA e la microiniezione di AAV nei lobi BAT.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Generazione di topi knockout specifici per il grasso bruno utilizzando un sistema combinato di RNA a guida singola Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e virus adeno-associato
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il tessuto adiposo bruno (BAT) è un deposito adiposo specializzato nella dissipazione di energia che può anche servire come organo endocrino attraverso la secrezione di molecole bioattive. La creazione di topi knockout specifici per BAT è uno degli approcci più popolari per comprendere il contributo di un gene di interesse alla regolazione dell'energia mediata da BAT. La strategia convenzionale di targeting genico che utilizza il sistema Cre-LoxP è stato l'approccio principale per generare topi knockout tessuto-specifici. Tuttavia, questo approccio richiede tempo e noia. Qui, descriviamo un protocollo per il knockout rapido ed efficiente di un gene di interesse in BAT utilizzando un sistema combinato Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e virus adeno-associato (AAV) a guida singola (sgRNA). Il BAT interscapolare si trova nello strato profondo tra i muscoli. Pertanto, il BAT deve essere esposto per iniettare l'AAV in modo preciso e diretto nel BAT all'interno del campo visivo. Una corretta manipolazione chirurgica è fondamentale per prevenire danni ai nervi e ai vasi simpatici, come la vena di Sultzer che si collega al BAT. Per ridurre al minimo il danno tissutale, vi è una necessità critica di comprendere la posizione anatomica tridimensionale del BAT e le competenze chirurgiche richieste nelle fasi tecniche. Questo protocollo evidenzia le procedure tecniche chiave, tra cui la progettazione di sgRNA mirati al gene di interesse, la preparazione di particelle AAV-sgRNA e l'intervento chirurgico per la microiniezione diretta di AAV in entrambi i lobi BAT per generare topi knockout specifici per BAT, che possono essere ampiamente applicati per studiare le funzioni biologiche dei geni nelle BAT.
Introduzione
L'obesità sta aumentando a un ritmo significativo in tutto il mondo, portando a un ampio spettro di malattie metaboliche 1,2,3. Il tessuto adiposo è fondamentale per queste patologie. I due tipi funzionalmente distinti di tessuto adiposo che esistono sono il tessuto adiposo bianco (WAT), che immagazzina calorie in eccesso, e il tessuto adiposo bruno (BAT) e il relativo grasso beige / brite, che dissipa energia per la termogenesi. Mentre il BAT è stato riconosciuto per la sua funzione di dissipazione dell'energia, ha anche funzioni endocrine attraverso la produzione d....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali e le procedure di cura sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso il Joslin Diabetes Center.
1. Screening di sgRNA efficaci in cellule in coltura
NOTA: Per rendere il test economicamente vantaggioso, prima di confezionare gli sgRNA in particelle AAV, si consiglia di testare diversi sgRNA in cellule coltivate tramite un sistema basato su lentivirus per l'espressione di Cas9/sgRNA (Figura 1) e selezionare gli sgRNA che danno la massima efficienza di knockdown per esperimenti in....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Durante le procedure di cui sopra, la consegna precisa di AAV-sgRNA alla BAT è cruciale per il successo del protocollo. Per massimizzare l'effetto di AAV-sgRNA e minimizzare il danno tissutale durante l'intervento chirurgico, è essenziale comprendere la posizione anatomica tridimensionale (3D) del BAT. Come mostrato nella Figura 3E, è difficile identificare la posizione precisa della BAT senza esporre il tessuto. Tuttavia, l'esposizione eccessiva alle BAT può danneggiare il tessuto (
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
I metodi pubblicati esistenti per la somministrazione genica mediata da AAV alla BAT interscapolare non contengono immagini e video dettagliati che descrivono le tecniche chirurgiche e l'approccio per l'iniezione diretta di AAV nel BAT. Nella maggior parte dei metodi pubblicati33,34, l'AAV viene iniettato nei tessuti adiposi che circondano il BAT interscapolare anziché nel BAT stesso. Quindi, ci sono diversi passaggi chiave in questo protocollo che determinano il.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato in parte dalle sovvenzioni del National Institutes of Health (NIH) degli Stati Uniti R01DK122808, R01DK102898 e R01DK132469 (a Y.-H.T.), nonché P30DK036836 (al Diabetes Research Center del Joslin Diabetes Center). T. T. è stato sostenuto dalla SUNSTAR Research Fellowship (Hiroo Kaneda Scholarship, Sunstar Foundation, Giappone) e dalla borsa di studio dell'American Heart Association 903968. Y. Z. è stato sostenuto dalla Charles A. King Trust Fellowship. Ringraziamo Sean D. Kodani per la gentile correzione del manoscritto.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sostanze chimiche, peptidi e proteine ricombinanti | |||
| terreno privo di siero | Invitrogen | 31985 | |
| Reagente per infezione/trasfezione da polibrene | Sigma | TR-1003-G | |
| TransIT-LT1 Reagente per trasfezione | Mirus | MIR 2300 | |
| DNA | |||
| lentiCRISPR v2 vettore | Addgene | 52961 | |
| pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP | Addgene | 89060 | |
| pMD2.G plasmide involucro | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 impacchettamento plasmide | Addgene | 12260 | |
| Modelli sperimentali: Linee | |||
| Cellule HEK-293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Cellule WT-1 | Sviluppato nel laboratorio Tseng | PMID: 14966273 | |
| Modelli sperimentali: Organismi/Ceppi | |||
| Cas9 topi knockin | Jackson Laboratories | 24857 | |
| Ucp1-CRE topi | Jackson Laboratories | 24670 | |
| Altri | |||
| Banamine | Patterson | 07-859-1323 | |
| Hamilton siringa | Hamilton | Modello 710 RN Siringa | |
| Soluzione di perossido di idrogeno | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Ago | Hamilton | 32 gauge, ago RN con mozzo piccolo, stile della punta dell'ago 2 | |
| Sutura 5-0 Unify PCL25 P-3 Monofilamento da 18 pollici non tinto 12/Bx | Henry Schein | 1273504 | |
| Sutura 5-0 Unify Silk P-3 Nero 18 pollici 12/Bx | Henry Schein |
Riferimenti
- Kopelman, P. G. Obesity as a medical problem. Nature. 404 (6778), 635-643 (2000).
- Finkelstein, E. A., et al. Obesity and severe obesity forecasts through 2030. American Journal of Preventive Medicine. 42 (6), 563-570 (2012).
- Craft, S.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
