Generering av bruna fettspecifika knockoutmöss med hjälp av ett kombinerat Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- och adenoassocierat virus med en guide RNA-system
Summary
I detta protokoll beskriver vi de tekniska procedurerna för att generera bruna fettvävnadsspecifika knockoutmöss (BAT) som utnyttjar ett kombinerat Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- och adenoassocierat virus (AAV) single-guide RNA (sgRNA) system. De beskrivna stegen innefattar utformningen av sgRNA, beredningen av AAV-sgRNA-partiklarna och mikroinjektionen av AAV i BAT-loberna.
Abstract
Brun fettvävnad (BAT) är en fettdepå specialiserad på energiavledning som också kan fungera som ett endokrint organ via utsöndring av bioaktiva molekyler. Skapandet av BAT-specifika knockoutmöss är en av de mest populära metoderna för att förstå bidraget från en gen av intresse för BAT-medierad energireglering. Den konventionella geninriktningsstrategin som använder Cre-LoxP-systemet har varit det huvudsakliga tillvägagångssättet för att generera vävnadsspecifika knockoutmöss. Detta tillvägagångssätt är dock tidskrävande och tråkigt. Här beskriver vi ett protokoll för snabb och effektiv knockout av en gen av intresse för BAT med hjälp av ett kombinerat Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 och adenoassocierat virus (AAV) single-guide RNA (sgRNA) system. Den interscapular BAT ligger i det djupa lagret mellan musklerna. BAT måste därför exponeras för att AAV ska kunna injiceras exakt och direkt i BAT inom synfältet. Lämplig kirurgisk hantering är avgörande för att förhindra skador på sympatiska nerver och kärl, såsom Sultzers ven som ansluter till BAT. För att minimera vävnadsskador finns det ett kritiskt behov av att förstå den tredimensionella anatomiska placeringen av BAT och de kirurgiska färdigheter som krävs i de tekniska stegen. Detta protokoll belyser de viktigaste tekniska procedurerna, inklusive utformningen av sgRNA som riktar sig mot genen av intresse, beredningen av AAV-sgRNA-partiklar och operationen för direkt mikroinjektion av AAV i båda BAT-loberna för att generera BAT-specifika knockoutmöss, som kan tillämpas brett för att studera de biologiska funktionerna hos gener i BAT.
Introduction
Fetma ökar i betydande takt över hela världen, vilket leder till ett brett spektrum av metaboliska sjukdomar 1,2,3. Fettvävnaden är nyckeln till dessa patologier. De två funktionellt distinkta typerna av fettvävnad som finns är vit fettvävnad (WAT), som lagrar överflödiga kalorier, och brun fettvävnad (BAT) och dess relaterade beige / britefett, som sprider energi för termogenes. BAT har erkänts för sin energiavledande funktion, men har också endokrina funktioner via produktion av bioaktiva molekyler som reglerar ämnesomsättningen i distala organ 4,5. Många studier på gnagare har visat att ökad mängd eller aktivitet av brunt eller beige fett leder till ökad energiförbrukning och förbättrad insulinkänslighet. Hos människor har personer med detekterbar BAT en signifikant lägre förekomst av kardiometaboliska sjukdomar6. BAT har således utmärkt terapeutisk potential för fetmarelaterade metabola följder 7,8,9.
För att undersöka fysiologin och patofysiologin för BAT-utveckling och funktion och för att belysa de molekylära mekanismer som är involverade i dessa processer är den BAT-specifika transgena musmodellen en metod som valts10. Cre-LoxP-rekombinationssystemet är det vanligaste sättet att producera villkorade knockoutmöss genom att redigera musgenomet. Detta system har möjliggjort modifiering (överuttryck eller knockout) av gener av intresse på ett vävnads-/cellspecifikt sätt11. Det kan också användas för att märka en specifik celltyp genom att uttrycka en selektiv fluorescerande reportergen.
Nyligen har Cre-LoxP-systemmetoden vidareutvecklats genom att kombinera CRISPR-Cas9-tekniken och adenoassocierat virus (AAV) single-guide RNA (sgRNA) system12. CRISPR-Cas9-systemet är ett specifikt och effektivt genredigeringsverktyg för att modifiera, reglera eller rikta in sig på exakta regioner i genomet13. CRISPR-Cas9-baserad genomredigering möjliggör snabb genetisk manipulation av genomiska loci eftersom det inte kräver homolog rekombination med en genmålande vektor. Kombinerade Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- och AAV-sgRNA-tekniker gör det möjligt för forskare att förstå genfunktioner mer exakt genom att möjliggöra undersökning av rollen för gener av intresse vid önskade tidpunkter i vävnader / celler. Dessutom minskar dessa kombinerade tekniker den tid och ansträngning som krävs för att generera transgena möss och möjliggör tidsmässig kontroll av CRISPR-Cas9-aktivitet för inducerbar genomredigering hos möss om en inducerbar Cre-linje används14.
AAV-vektorer är säkra och effektiva di vivo-genleveranssystem. AAV: er som riktar sig mot fettvävnad har dock släpat efter applikationer i andra vävnader, såsom hjärna, hjärta, lever och muskel15. På grund av den relativt låga transduktionseffektiviteten och tropismen med naturligt förekommande serotypvektorer är AAV-styrd genleverans till fettvävnad fortfarande utmanande15. Under de senaste 5 åren har vi och andra framgångsrikt etablerat effektiva och minimalt invasiva sätt att leverera AAV-styrda gener till fettvävnad och skapat musmodeller som gör det möjligt för oss att få en förståelse för de gener som är involverade i regleringen av BAT-funktion16,17,18,19. Genom att till exempel använda AAV8 för att leverera sgRNA riktat mot Alox12, som kodar för 12-lipoxygenas (12-LOX), i BAT hos Ucp1-Cre/Cas9-mössen, har vi upptäckt att aktiverad BAT producerar 12-LOX-metaboliter, nämligen 12-hydroxi-eikosapentaensyra (12-HEPE) och 13R, 14S-dihydroxidokosahexaensyra (maresin 2), för att reglera glukosmetabolismen och lösa fetma-associerad inflammation, respektive16, 17. Här tillhandahåller vi ett steg-för-steg-protokoll om de tekniska procedurerna, särskilt kirurgi för direkt mikroinjektion av AAV-sgRNA i BAT-loberna, för att generera BAT-specifika knockoutmöss med hjälp av det kombinerade Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- och AAV-sgRNA-systemet.
Protocol
Representative Results
Discussion
De befintliga publicerade metoderna för AAV-medierad genleverans till interscapular BAT innehåller inga detaljerade bilder och videor som beskriver de kirurgiska teknikerna och tillvägagångssättet för direkt AAV-injektion i BAT. I de flesta av de publicerade metoderna33,34 injiceras AAV i fettvävnaderna som omger interscapular BAT i stället för själva BAT. Därför finns det flera viktiga steg i detta protokoll som avgör studiens framgång. Dessa inklu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av U.S. National Institutes of Health (NIH) bidrag R01DK122808, R01DK102898 och R01DK132469 (till Y.-H.T.), samt P30DK036836 (till Joslin Diabetes Center’s Diabetes Research Center). TT stöddes av SUNSTAR Research Fellowship (Hiroo Kaneda Scholarship, Sunstar Foundation, Japan) och American Heart Association grant 903968. Y. Z. stöddes av Charles A. King Trust Fellowship. Vi tackar Sean D. Kodani för vänligheten att korrekturläsa manuskriptet.
Materials
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| OPTI-MEM serum-free medium | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma | TR-1003-G | |
| TransIT-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| Recombinant DNA | |||
| lentiCRISPR v2 vector | Addgene | 52961 | |
| pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP | Addgene | 89060 | |
| pMD2.G envelope plasmid | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 packaging plasmid | Addgene | 12260 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| WT-1 cells | Developed in Tseng lab | PMID: 14966273 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Cas9 knockin mice | Jackson Laboratories | 24857 | |
| Ucp1-CRE mice | Jackson Laboratories | 24670 | |
| Others | |||
| Banamine | Patterson | 07-859-1323 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | Model 710 RN Syringe | |
| Hydrogen peroxide solution | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Needle | Hamilton | 32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2 | |
| Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx | Henry Schein | 1273504 | |
| Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx | Henry Schein | 1294522 |
Riferimenti
- Kopelman, P. G. Obesity as a medical problem. Nature. 404 (6778), 635-643 (2000).
- Finkelstein, E. A., et al. Obesity and severe obesity forecasts through 2030. American Journal of Preventive Medicine. 42 (6), 563-570 (2012).
- Craft, S. Insulin resistance and Alzheimer’s disease pathogenesis: Potential mechanisms and implications for treatment. Current Alzheimer Research. 4 (2), 147-152 (2007).
- Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. Brown adipose tissue as a secretory organ. Nature Reviews Endocrinology. 13 (1), 26-35 (2017).
- Scheele, C., Wolfrum, C. Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism. Endocrine Reviews. 41 (1), 53-65 (2020).
- Becher, T., et al. Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health. Nature Medicine. 27 (1), 58-65 (2021).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: Physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).
- Darcy, J., Tseng, Y. H. ComBATing aging-does increased brown adipose tissue activity confer longevity. Geroscience. 41 (3), 285-296 (2019).
- da Silva Xavier, G., Hodson, D. J. Mouse models of peripheral metabolic disease. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 32 (3), 299-315 (2018).
- Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: General principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory Animal Research. 34 (4), 147-159 (2018).
- Wang, D., Zhang, F., Gao, G. CRISPR-based therapeutic genome editing: Strategies and in vivo delivery by AAV vectors. Cell. 181 (1), 136-150 (2020).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Dow, L. E., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33 (4), 390-394 (2015).
- Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: An emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
- Sugimoto, S., et al. Brown adipose tissue-derived MaR2 contributes to cold-induced resolution of inflammation. Nature Metabolism. 4 (6), 775-790 (2022).
- Leiria, L. O., et al. 12-lipoxygenase regulates cold adaptation and glucose metabolism by producing the omega-3 lipid 12-HEPE from brown fat. Cell Metabolism. 30 (4), 768-783 (2019).
- Shamsi, F., et al. FGF6 and FGF9 regulate UCP1 expression independent of brown adipogenesis. Nature Communications. 11, 1421 (2020).
- Romanelli, S. M., et al. BAd-CRISPR: Inducible gene knockout in interscapular brown adipose tissue of adult mice. Journal of Biological Chemistry. 297 (6), 101402 (2021).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9, 5416 (2018).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
- Tseng, Y. H., Kriauciunas, K. M., Kokkotou, E., Kahn, C. R. Differential roles of insulin receptor substrates in brown adipocyte differentiation. Molecular and Cellular Biology. 24 (5), 1918-1929 (2004).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: Sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
- Jarrett, K. E., et al. Somatic genome editing with CRISPR/Cas9 generates and corrects a metabolic disease. Scientific Reports. 7, 44624 (2017).
- Zhang, Y., et al. Optimized RNA-targeting CRISPR/Cas13d technology outperforms shRNA in identifying functional circRNAs. Genome Biology. 22 (1), 41 (2021).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).
- Jimenez, V., et al. In vivo adeno-associated viral vector-mediated genetic engineering of white and brown adipose tissue in adult mice. Diabetes. 62 (12), 4012-4022 (2013).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Huang, W., Queen, N. J., Cao, L. rAAV-mediated gene delivery to adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1950, 389-405 (2019).
- Xue, K., Wu, D., Qiu, Y. Specific and efficient gene knockout and overexpression in mouse interscapular brown adipocytes in vivo. STAR Protocols. 3 (4), 101895 (2022).
