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Bioengineering

जीन-संशोधित टी कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए एक जीएमपी-अनुरूप प्रक्रिया

Published: October 6, 2023 doi: 10.3791/65097
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Institute of Cell Therapy, Bone Marrow Transplantation Lab, Department of Medicine, University of Patras, 2Protatonce Ltd, Demokritos Science Park

Summary

यह प्रोटोकॉल ब्याज की जीन के साथ प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने की प्रक्रिया की रूपरेखा तैयार करता है, जो अच्छे विनिर्माण अभ्यास (जीएमपी) मानकों के साथ संगतता सुनिश्चित करता है।

Abstract

एडॉप्टिव सेल थेरेपी (एसीटी) के क्षेत्र में आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं, विशेष रूप से काइमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) -टी कोशिकाओं के विकास से क्रांति आई है। इन संशोधित कोशिकाओं ने हेमटोलोगिक विकृतियों वाले रोगियों में उल्लेखनीय नैदानिक प्रतिक्रियाएं दिखाई हैं। हालांकि, इन उपचारों के उत्पादन और व्यापक गुणवत्ता नियंत्रण आकलन करने की उच्च लागत ने रोगियों की एक विस्तृत श्रृंखला तक उनकी पहुंच को सीमित कर दिया है। इस मुद्दे को हल करने के लिए, कई शैक्षणिक संस्थान राष्ट्रीय और अंतर्राष्ट्रीय नियामक एजेंसियों द्वारा निर्धारित दिशानिर्देशों का पालन करते हुए, आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं के इन-हाउस विनिर्माण की व्यवहार्यता का पता लगा रहे हैं।

बड़े पैमाने पर आनुवंशिक रूप से संशोधित टी सेल उत्पादों का निर्माण कई चुनौतियों को प्रस्तुत करता है, विशेष रूप से संस्था की उत्पादन क्षमताओं और जलसेक मात्रा आवश्यकताओं को पूरा करने की आवश्यकता के संदर्भ में। एक बड़ी चुनौती में गुड मैन्युफैक्चरिंग प्रैक्टिस (जीएमपी) दिशानिर्देशों के तहत बड़े पैमाने पर वायरल वैक्टर का उत्पादन शामिल है, जिसे अक्सर बाहरी कंपनियों को आउटसोर्स किया जाता है। इसके अतिरिक्त, टी सेल पारगमन प्रक्रिया को सरल बनाने से उत्पादन बैचों के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने, लागत कम करने और कर्मियों के प्रशिक्षण की सुविधा में मदद मिल सकती है। इस अध्ययन में, हम ब्याज के जीन के रूप में फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं के लेंटिवायरल पारगमन के लिए एक सुव्यवस्थित प्रक्रिया की रूपरेखा तैयार करते हैं। पूरी प्रक्रिया जीएमपी-अनुरूप मानकों का पालन करती है और हमारे शैक्षणिक संस्थान के भीतर लागू की जाती है।

Introduction

दत्तक सेल थेरेपी (एसीटी) और काइमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) -टी कोशिकाओं के उद्भव ने आधुनिक नैदानिक अभ्यास में एक क्रांतिकारी बदलाव लाया है, जो व्यक्तिगत चिकित्सा का एक नया प्रतिमान स्थापित करता है। विशेष रूप से, सीडी 19 को लक्षित करने वाली सीएआर-टी कोशिकाओं ने असाधारण नैदानिक प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन किया है और बी सेल दुर्दमताओं 1,2,3,4,5के लिए सबसे उन्नत टी सेल थेरेपी का प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि, वर्तमान व्यावसायिक जीन-संशोधित टी सेल थेरेपी जीन ट्रांसफर के लिए वायरल वैक्टर पर बहुत अधिक निर्भर करती हैं। अधिनियम में वायरल वैक्टर के कार्यान्वयन, विशेष रूप से अच्छा विनिर्माण अभ्यास के तहत (जीएमपी) एक अकादमिक सेटिंग के भीतर शर्तों, स्केलेबिलिटी सीमाओं, विशेष उपकरण आवश्यकताओं, अत्यधिक कुशल कर्मियों के लिए की आवश्यकता, और प्लाज्मिड के लिए जीएमपी अनुरूप अभिकर्मकों के उपयोग के कारण महत्वपूर्ण चुनौतियों प्रस्तुत करता है-मध्यस्थता वायरल कण उत्पादन 6,7,8.

नतीजतन, जीन-संशोधित टी सेल थेरेपी के लिए विनिर्माण प्रक्रिया जटिल है और आमतौर पर ल्यूकाफेरेसिस उत्पाद से परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) के अलगाव के साथ शुरू होती है। टी कोशिकाओं अक्सर PBMC पूल से समृद्ध और विरोधी CD3/CD28 सूक्ष्म परिसरों 7,9 का उपयोग कर सक्रिय कर रहे हैं. इसके बाद, टी कोशिकाओं को आनुवंशिक रूप से वायरल या गैर-वायरल वैक्टर के साथ संशोधित किया जाता है, जिसे सीटू या आउटसोर्स में उत्पादित किया जा सकता है। जलसेक के लिए आवश्यक सेल नंबर प्राप्त करने के लिए, जीन-संशोधित कोशिकाओं को अंतिम सूत्रीकरण और / या क्रायोप्रिजर्वेशन से पहले विस्तारित किया जाता है। अंत में, सेल उत्पाद को कई गुणवत्ता नियंत्रणपरख9के आधार पर विभिन्न रिलीज मानदंडों को पूरा करना होगा।

यह प्रोटोकॉल जीएमपी-अनुरूप स्थितियों के तहत जीन-संशोधित टी सेल उत्पाद का निर्माण करने के लिए स्वस्थ पीबीएमसी के पूर्व विवो हेरफेर के लिए सरल तकनीकों का उपयोग करके एक व्यापक पद्धति प्रस्तुत करता है। प्रोटोकॉल में एक लेंटिवायरल वेक्टर का उपयोग शामिल है, जिसे एक वायरल उत्पादन कंपनी को आउटसोर्स किया जा सकता है जो सभी आवश्यक मात्रात्मक / कार्यात्मक, शुद्धता और सुरक्षा परीक्षण (जैसे, वायरल टिटर, मेजबान सेल डीएनए प्रतिकृति-सक्षम लेंटवायरस का पता लगाना) प्रदान करता है। इस अध्ययन के लिए, नियोजित वेक्टर एक वीएसवी-जी (वेसिकुलर स्टामाटाइटिस वायरस जी प्रोटीन) है, जो ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के साथ दूसरी पीढ़ी के लेंटिवायरल वेक्टर पर आधारित है, जो संवैधानिक अभिव्यक्ति में रुचि के जीन के रूप में है।

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Protocol

इस अध्ययन को पेट्रास विश्वविद्यालय की आचार समिति और पैट्रास के विश्वविद्यालय जनरल अस्पताल के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था। जैविक नमूने प्राप्त करने से पहले, स्वस्थ व्यक्तियों से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी। प्रतिभागियों की पात्रता मूल्यांकन संस्थागत प्रक्रियाओं के अनुसार और ल्यूकाफेरेसिस के लिए जेएसीआईई मानकों के अनुपालन में आयोजित किया गया था। यदि इस प्रोटोकॉल को नैदानिक अधिनियम सेटिंग में लागू किया जाना है, तो सभी प्रक्रियाओं को अच्छा विनिर्माण अभ्यास (जीएमपी) दिशानिर्देशों का पालन करना चाहिए और जीएमपी-अनुरूप स्वच्छ कमरे में प्रदर्शन किया जाना चाहिए। वायरल वैक्टर के साथ काम करते समय विशेष सुरक्षा सावधानी आवश्यक है, और इन प्रक्रियाओं को एक समर्पित जैव सुरक्षा कैबिनेट के भीतर आयोजित किया जाना चाहिए। इस अध्ययन में, वर्णित प्रक्रियाओं को एक नियंत्रित और निगरानी वातावरण सुनिश्चित करने के लिए एक मान्य एच 35 एचईपीए हाइपोक्सीस्टेशन ( सामग्री की तालिकादेखें) के भीतर आयोजित किया गया था। सभी खतरनाक तरल पदार्थों का परिशोधन 10% ब्लीच समाधान का उपयोग करके किया जाना चाहिए।

1. पीबीएमसी अलगाव और टी सेल सक्रियण (दिन 0)

  1. प्रारंभिक मात्रा के आधार पर, दाता एफेरेसिस बैग (ल्यूकोपैक, सामग्री की तालिकादेखें) से कोशिकाओं को 50 एमएल ट्यूबों में इकट्ठा करें।
  2. पूर्ण हेमटोपोइएटिक मीडिया (+ 5% एचएसए, वाणिज्यिक सीरम मुक्त हेमटोपोइएटिक मीडिया, सामग्री की तालिका) के 15 एमएल को संक्रमित करके सेल बैग के दो वॉश करें।
  3. एक 1: 2 (अभिकर्मक: नमूना) कमजोर पड़ने पर polysaccharide आधारित घनत्व ढाल centrifugation का संचालन. ब्रेक ऑफ (ए / डी, 9/0) के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  4. एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, पीबीएमसी को एक साफ 50 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें।
  5. कोशिकाओं को 1x पीबीएस के साथ दो बार धोएं, प्रत्येक धोने के लिए 50 एमएल तक भरें (400 x ग्राम, 10 मिनट, कमरे का तापमान)। पूर्ण मीडिया के 5 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  6. एक मानक हेमोसाइटोमीटर या एक स्वचालित सेल काउंटर ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके ट्रिपैन ब्लू का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
  7. एमएल की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पूर्ण मीडिया के साथ कोशिकाओं को पतला करें।
  8. टी सेल उत्तेजना अभिकर्मक के 10 माइक्रोन जोड़कर 20 x 106 पीबीएमसी को सक्रिय करें ( सामग्री की तालिकादेखें) प्रति 2 x 106 शुरुआती कोशिकाएं।
    नोट: यह प्रोटोकॉल 20 x 106 PBMC के सक्रियण के लिए डिज़ाइन किया गया है, लेकिन आवश्यकतानुसार बड़े सेल नंबरों के लिए समायोजित किया जा सकता है।
  9. आरएचआईएल-2 (20 यू/एमएल) जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें), धीरे से मिलाएं, और मिश्रण को एक उपयुक्त बर्तन (जैसे, 6-अच्छी प्लेट) में स्थानांतरित करें।
  10. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, 72 घंटे के लिए 5% सीओ2 ।

2. लेंटीवायरल टी सेल ट्रांसडक्शन (दिन 3)

  1. सेल संस्कृति को एक उपयुक्त पोत में स्थानांतरित करें, जैसे कि 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब। सक्रियण अभिकर्मक को हटाने के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अच्छी तरह से मिलाएं और अपकेंद्रित्र करें। ध्यान से सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से त्यागें और पूर्ण माध्यम के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें।
    नोट: इस स्तर पर, बर्फ पर वायरस पिघलना संभव है।
  2. trypan नीले का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना.
  3. एक एकाग्रता है कि एक 24 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से 400 माइक्रोन की कुल मात्रा में 0.5 x 106 कोशिकाओं चढ़ाना के लिए अनुमति देता है प्राप्त करने के लिए पूर्ण माध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें. rhIL-7 (155 U/mL) और rhIL-15 (290 U/mL) जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    नोट: जोड़े जाने वाले वायरस की मात्रा के लिए खाता सुनिश्चित करें। चरण 2.4 का संदर्भ लें।
  4. एक अलग ट्यूब में, वेक्टोफ्यूसिन -1 ( सामग्री की तालिकादेखें) को ऑप्टि-एमईएम माध्यम में 10 μg/mL की एकाग्रता पर जोड़ें, जिसमें वायरल वॉल्यूम के बराबर मात्रा का उपयोग किया जाएगा।
    नोट: वेक्टोफ्यूसिन -1 की एकाग्रता की गणना करते समय कुल सेल संस्कृति मात्रा पर विचार करें। चरण 2.3 देखें। वैकल्पिक रूप से, वेक्टोफ्यूसिन -1 जीएमपी का उपयोग जीएमपी-ग्रेड अभिकर्मक के रूप में किया जा सकता है।
  5. 40 के संक्रमण की बहुलता (एमओआई) पर केंद्रित वायरस को वेक्टोफ्यूसिन-1/ऑप्टि-एमईएम मिश्रण (1:1 अनुपात) के साथ मिलाएं और अच्छी तरह मिलाएं। सेल संस्कृति के लिए इस मिश्रण जोड़ें और यदि आवश्यक हो तो पूरा माध्यम का उपयोग कर अच्छी तरह से प्रति 400 माइक्रोन करने के लिए कुल मात्रा समायोजित.
  6. प्लेट पर ढक्कन रखें, इसे पैराफिन फिल्म के साथ सील करें, और 32 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 1000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। इसके बाद, प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 रातोंरात इनक्यूबेट करें।

3. वायरस हटाने और टी सेल विस्तार (दिन 4)

  1. कोशिकाओं को लीजिए और उन्हें एक उपयुक्त पोत, जैसे 50 एमएल ट्यूब में पूल करें।
  2. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 400 x ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें। ध्यान से सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से हटा दें और पूरा मीडिया के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें।
  3. trypan नीले का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना. 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता पर पूर्ण मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। rhIL-7 (155 U/mL) और rhIL-15 (290 U/mL) जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  4. कोशिकाओं को एक उपयुक्त पोत में स्थानांतरित करें, जैसे कि टी 25 फ्लास्क, 0.3-0.5 x 106 कोशिकाओं / सेमी2 की एकाग्रता पर और उन्हें 2 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: यदि एक बड़ी सेल आबादी की आवश्यकता होती है, तो कोशिकाओं को हर 2 दिनों में rhIL7 और rhIL-15 की उपस्थिति में उपसंस्कृति (1: 2) किया जा सकता है, ऊपर वर्णित समान इनक्यूबेशन स्थितियों का पालन करते हुए, जब तक कि वांछित सेल नंबर हासिल नहीं हो जाते।

4. क्रायोप्रिजर्वेशन (दिन 14)

नोट: इस चरण के दौरान क्रायोवियल्स को भंडारण स्थान पर स्थानांतरित करने के लिए बर्फ की आवश्यकता होगी। क्रायोप्रिजर्वेशन का समय वांछित सेल नंबरों पर निर्भर करता है। इस प्रोटोकॉल के लिए, क्रायोप्रेज़र्वेशन 25 गुना विस्तार प्राप्त करने के बाद 14 वें दिन किया जाता है।

  1. एक बार वांछित सेल संख्या तक पहुँच गया है, कोशिकाओं फसल और उन्हें 50 एमएल ट्यूबों (कुल मात्रा के आधार पर ट्यूबों की संख्या को समायोजित) के लिए हस्तांतरण.
  2. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 400 x ग्राम पर ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें। ध्यान से सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से हटा दें और मीडिया के 10 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें। यदि आवश्यक हो, तो कई ट्यूबों से कोशिकाओं को पूल करें।
  3. trypan नीले का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना. वेक्टर कॉपी संख्या और पारगमन दक्षता का आकलन करने के लिए प्रत्येक गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) परीक्षण (धारा 5 देखें) के लिए 1 x 106 कोशिकाओं का एक विभाज्य रखें।
  4. आरटी पर 10 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें। इस बिंदु पर, क्रायोवियल्स को तदनुसार लेबल करें।
  5. सतह पर तैरनेवाला को पूरी तरह से हटा दें और क्रायोप्रिजर्वेशन समाधान में गोली को फिर से निलंबित करें जिसमें 50% एचएसए और 40% एचबीएसएस शामिल हैं, जो 1 x 107 कोशिकाओं प्रति एमएल प्रति क्रायोवियल की एकाग्रता पर है। सेल निलंबन को क्रायोवियल की उचित संख्या में स्थानांतरित करें और प्रत्येक क्रायोवियल में 10% डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ) जोड़ें।
  6. क्रायोवियल्स को बर्फ पर रखें और क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए उन्हें तुरंत नियंत्रित दर वाले फ्रीजर में स्थानांतरित करें। क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद, क्रायोवियल्स को दीर्घकालिक भंडारण के लिए मॉनिटर किए गए तरल नाइट्रोजन टैंक में स्थानांतरित करें।

5. गुणवत्ता नियंत्रण (दिन 14)

नोट: रिलीज परीक्षण के लिए, उत्पाद ने माइक्रोबियल विकास के लिए बाँझपन परीक्षण और एंडोटॉक्सिन स्तर मूल्यांकन सहित कई परीक्षण किए। ये परीक्षण यूनिवर्सिटी जनरल हॉस्पिटल ऑफ पेट्रास और पैट्रास विश्वविद्यालय में प्रमाणित प्रयोगशालाओं में आयोजित किए गए थे। माइकोप्लाज्मा उपस्थिति एक जैव रासायनिक पहचान परख का उपयोग कर घर में निर्धारित किया गया था और निर्माता के निर्देशों (सामग्री की तालिकादेखें) के बाद एक luminometer पर मापा गया. सेल फेनोटाइप (चित्रा 1) के साथ-साथ सेल नंबर और व्यवहार्यता का मूल्यांकन क्रमशः प्रवाह साइटोमेट्री (अनुभाग 5.1 देखें) और एक स्वचालित सेल काउंटर (सामग्री की तालिका) द्वारा घर में किया गया था। जीएमपी उत्पादित सेल उत्पादों(तालिका 1)के लिए प्रकाशित आंकड़ों और सिफारिशों10,11 के आधार पर रिलीज मानदंड स्थापित किए गए थे।

  1. ट्रांसडक्शन दक्षता-प्रवाह साइटोमेट्री धुंधला प्रदर्शन (दिन 14)
    नोट: 1 x 106 कोशिकाओं का एक विभाज्य व्यवहार्यता (7-एएडी) और सीडी 3 मार्कर2 के लिए पारगमन दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए दाग दिया जाएगा ( सामग्री की तालिकादेखें)। यदि ब्याज के जीन, जैसे कि कार टी कोशिकाओं के मामले में, का पता लगाने की आवश्यकता है, तो मुआवजे से बचने के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी सीडी 3 मार्कर और 7-एएडी से अलग रंग में होनी चाहिए। उचित नियंत्रण नमूनों को ध्यान में रखा जाना चाहिए।
    1. नमूना को एफएसीएस ट्यूब में रखें और एफएसीएस बफर के 500 माइक्रोन जोड़ें।
    2. 5 मिनट के लिए आरटी पर 400 x ग्राम पर ट्यूब अपकेंद्रित्र.
    3. पूरी तरह से एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला त्यागें और एक 1 में गोली reslunged: सीडी 3 के 5 पतला समाधान: FACS बफर ( सामग्री की तालिकादेखें).
    4. भंवर नमूना और अंधेरे में बर्फ पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
    5. FACS बफर के 500 माइक्रोन जोड़ें। 5 मिनट (आरटी) के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    6. सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से त्यागें और 7-एएडी के 1:20 पतला समाधान में गोली को फिर से निलंबित करें: एफएसीएस बफर ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    7. भंवर नमूना और अंधेरे में बर्फ पर 10 मिनट के लिए सेते हैं.
    8. एफएसीएस बफर के 200 माइक्रोन जोड़ें और प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके नमूने का विश्लेषण करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।

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Representative Results

पारगमन दक्षता का आकलन
प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके ब्याज की जीन (जीएफपी) की अभिव्यक्ति के लिए ट्रांसड्यूड कोशिकाओं का मूल्यांकन किया गया था। प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 1 में दर्शाया गया है. 14 दिन, 95% से अधिक कोशिकाएं सीडी 3 + थीं, जो सफल टी सेल सक्रियण और विस्तार का संकेत देती हैं। सीडी 3 + आबादी के भीतर पारगमन दक्षता को गैर-ट्रांसड्यूड कोशिकाओं (यूएनटीडी, चित्रा 1 बी) की तुलना में 58.7% (टीडी, चित्रा 1 सी) पर मापा गया था, जिसने 0.51% की पारगमन दक्षता का प्रदर्शन किया था। व्यवहार्यता विश्लेषण से पता चला है कि 95% से अधिक कोशिकाएं 7-एएडी + कोशिकाओं (चित्रा 1 ए) को छोड़कर जीवित थीं। फ्लोजो सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग डेटा विश्लेषण के लिए किया गया था।

विस्तार प्रोफाइल का आकलन
ट्रांसड्यूड कोशिकाओं को rhIL-7 (155 U/mL) और rhIL-15 (290 U/mL) की उपस्थिति में दिन 4 से क्रायोप्रिजर्वेशन (दिन 14) तक विस्तारित किया गया था। सबकल्चरिंग हर 2 दिनों में की गई थी। कोशिकाओं को एक 25 गुना विस्तार से गुजरना पड़ा, के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया है, प्रारंभिक सेल गिनती के आधार पर चिकित्सकीय प्रासंगिक सेल नंबर तक पहुँचने.

गुणवत्ता नियंत्रण का आकलन
उत्पाद विभिन्न गुणवत्ता नियंत्रण परीक्षणों से गुजरा, जिसमें बाँझपन परीक्षण, माइकोप्लाज्मा का पता लगाना और एंडोटॉक्सिन के स्तर का आकलन शामिल है। इसके अतिरिक्त, कार्यात्मक लक्षण वर्णन तालिका 1 में उल्लिखित मानदंडों के अनुसार किया गया था। उत्पाद सभी निर्धारित मानदंडों को पूरा करता है, जो आगे उपयोग के लिए इसकी उपयुक्तता का संकेत देता है।

Figure 1
चित्रा 1: मानव प्राथमिक सीडी 3 + टी कोशिकाओं पर जीएफपी ट्रांसजीन की अभिव्यक्ति दिखाते हुए प्रतिनिधि परिणाम। विश्लेषण सिंगलेट जीवित (7-एएडीनकारात्मक) कोशिकाओं (ए) पर किया गया था। ट्रांसड्यूस्ड (टीडी) कोशिकाओं (सी) की सकारात्मकता सीमा गैर-ट्रांसड्यूड (यूएनटीडी) आबादी (बी) के आधार पर निर्धारित की गई थी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ट्रांसड्यूड टी कोशिकाओं का विस्तार प्रोफ़ाइल। ट्रांसड्यूड (टीडी) टी कोशिकाओं को हर 2 दिनों (एन = 3) के साथ 10 दिनों के लिए आरएचआईएल -7 और आरएचआईएल -15 की उपस्थिति में विस्तारित किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

मूल्यांकन विधि कसौटी
निर्जीवाणुकता टीएसए (ट्रिप्टिक सोया अगर) या एसडीए (सबौरौड डेक्सट्रोज अगर) प्लेटों पर सूक्ष्मजीवों का विकास (आउटसोर्स या प्रमाणित माइक्रोबायोलॉजी लैब का सहयोग) 7 दिनों के बाद नकारात्मक
माइकोप्लाज्मा माइकोएलर्ट प्लस डिटेक्शन किट नेगटिव
एंडोटॉक्सिन जेल क्लॉट लिमुलस अमोबेसाइट लाइसेट (एलएएल) परीक्षण (विश्वविद्यालय के सार्वजनिक स्वास्थ्य विभाग के भीतर प्रमाणित प्रयोगशाला को आउटसोर्स या सहयोग करना) <0.5 ईयू/एमएल
सेल फेनोटाइप फ्लो साइटोमेट्री (घर में) सीडी 3 + ≥80%
GFP+ ≥30% (पारगमन दक्षता)
सेल नंबर स्वचालित काउंटर (घर में) >1 x 108 सेल
व्यावहारिकता ट्रिपैन ब्लू स्टेन (घर में) ≥70% जीवित कोशिकाएं
ट्रांसजीन प्रतियां/सेल रीयल-टाइम पीसीआर (घर में) ≤50 प्रतियां/μg डीएनए

तालिका 1: सेल उत्पाद के लिए रिलीज मानदंड।

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Discussion

जीन वितरण वाहनों के रूप में लेंटीवायरल वैक्टर सेल और जीन थेरेपी के क्षेत्र में महत्वपूर्ण उपकरण हैं क्योंकि विभाजित और गैर-विभाजित कोशिकाओं12 दोनों को ट्रांसड्यूस करने की उनकी क्षमता है। हालांकि, जीएमपी-संगत तरीकों का उपयोग करके लेंटिवायरल वैक्टर का बड़े पैमाने पर उत्पादन अभी भी विभिन्न मापदंडों के कारण चुनौतीपूर्ण है, जैसे कि अभिकर्मक विधियों और शुद्धिकरण चरण, जिसके परिणामस्वरूप लेंटवायरस बैचों में परिवर्तनशीलता हो सकती है। शैक्षणिक केंद्रों अक्सर वायरल उत्पादन जैव प्रौद्योगिकी कंपनियों, जो कार्यक्षमता और वायरस की सुरक्षा पर प्रलेखन प्रदान रिलीज मानदंड13,14 को पूरा करने से वायरल स्टॉक प्राप्त.

एक सफल पारगमन प्रोटोकॉल न केवल वायरल स्टॉक की गुणवत्ता पर बल्कि लक्ष्य कोशिकाओं की फिटनेस पर भी निर्भर करता है। पीबीएमसी की कुशल उत्तेजना महत्वपूर्ण है क्योंकि सक्रियण चरण में विफलता से कम पारगमन दक्षता हो सकती है। इसके अतिरिक्त, प्रमोटर और लिफाफा प्रोटीन की पसंद पारगमन प्रोटोकॉल15,16 की दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं. विभिन्न पारगमन बढ़ाने वाले अलग-अलग गुण रखते हैं जो वायरल कणों को लक्ष्यकोशिकाओं 17,18,19,20में सफल रूप से शामिल करने की सुविधा प्रदान करते हैं। वेक्टोफ्यूसिन -1, एक गैर विषैले हिस्टिडीन युक्त एम्फीपैथिक पेप्टाइड, सेल संस्कृति सतहों18 पर पूर्व कोटिंग के लिए की आवश्यकता को समाप्त करके पारगमन प्रक्रिया को कारगर बनाता है कि एक पारगमन बढ़ाने के रूप में कार्य करता है. इसके अलावा, spinoculation की तरह तरीकों वायरस21 के लिए लक्ष्य कोशिकाओं की संवेदनशीलता बढ़ाने के लिए दिखाया गया है. साइटोकिन्स एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं क्योंकि वे पूर्ण टी सेल सक्रियण के लिए कॉस्टिमुलेटरी सिग्नल प्रदान करते हैं और टी कोशिकाओं के प्रसार, अस्तित्व और कार्य पर प्लियोट्रोपिक प्रभाव डालते हैं। आईएल -7 और आईएल -15 पूरकता उच्च प्रसार क्षमता और कम एपोप्टोटिक दर 22,23,24के कारण कार टी सेल विस्तार के लिए अनुकूल वातावरण बनाता है। इस प्रोटोकॉल में, टी कोशिकाओं (>50%) के पारगमन को प्राप्त करने के लिए एक उच्च एमओआई (एमओआई = 40) मनाया गया था, जो अन्य पारगमनप्रोटोकॉल25,26के अनुरूप था।

जीएमपी स्थितियों के तहत निर्मित सेल उत्पाद की गुणवत्ता काफी हद तक विनिर्माण सुविधाओं, उपकरण, और जीएमपी-ग्रेड सहायक सामग्री की उपलब्धता और गुणवत्ता पर निर्भर करती है। वर्तमान उत्पाद का उत्पादन बिल्डिंग मॉनिटरिंग सिस्टम (बीएमएस) से लैस जीएमपी सुविधा में किया गया था जो सभी स्वच्छ कमरों (ग्रेड डी, सी, बी और ए) में पर्यावरण की स्थिति को नियंत्रित और लॉग करता है। रिलीज परीक्षण के लिए, इस उत्पाद ने कार्यात्मक लक्षण वर्णन परीक्षणों के साथ माइक्रोबियल विकास, माइकोप्लाज्मा का पता लगाने और एंडोटॉक्सिन स्तर मूल्यांकन के लिए बाँझपन परीक्षण किया, या तो प्रमाणित प्रयोगशालाओं या इन-हाउस में प्रदर्शन किया, सभी निर्धारित मानदंडों (तालिका 1) को पूरा किया।

वर्तमान में, अधिकांश टी सेल थेरेपी स्वचालित बंद प्रणालियों जैसे क्लिनीएमएसीएस प्रोडिजी (मिल्टेनी बायोटेक, जर्मनी) या कोकून (लोन्ज़ा, स्विट्जरलैंड) में निर्मित होते हैं, जो विकास के तहत कई अन्य लोगों के बीच होते हैं, जो लॉट 11,27,28के बीच हैंडलिंग और स्थिरता में आसानी प्रदान करते हैं। हालांकि, यह जीन थेरेपी के उत्पादन को विशेष केंद्रों और प्रति रन एक उत्पाद तक सीमित करता है। वर्तमान प्रोटोकॉल को निर्धारित रिलीज मानदंडों को पूरा करते हुए विशेष उपकरणों की खरीद से जुड़ी लागत को कम करने के लिए एक खुली प्रक्रिया के रूप में विकसित किया गया है। अंत में, एक सरलीकृत, लागत प्रभावी, और जीएमपी अनुरूप प्रोटोकॉल एक पर्याप्त पारगमन दक्षता (>50%) के साथ एक जीन संशोधित टी सेल उत्पाद उत्पन्न करने के लिए उल्लिखित है, एक अकादमिक सेटिंग में कार टी सेल उत्पादन के लिए लागू.

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Disclosures

एनएस ने प्रोटोकॉल विकसित किया और पांडुलिपि लिखी जिसकी समीक्षा और पर्यवेक्षण एएस द्वारा किया गया; केएस, जीए ने अतिरिक्त प्रयोग किए; डीके, एमएल ने प्रयोगों में और समीक्षा प्रक्रिया में वीजेड, एनटी के साथ मूल्यवान समर्थन प्रदान किया। N.T. ProtATonce लिमिटेड का सदस्य है अन्य सभी लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

इस शोध को यूरोपीय संघ और ग्रीक राष्ट्रीय निधियों द्वारा ऑपरेशनल प्रोग्राम कॉम्पिटिटिवनेस, एंटरप्रेन्योरशिप और इनोवेशन के माध्यम से RESEARCH - CREATE - INNOVATE (प्रोजेक्ट कोड: T2EDK - 00474) के तहत सह-वित्तपोषित किया गया है। हम इंस्टीट्यूट ऑफ सेल थेरेपी के जीएमपी लैब "दिमित्रिस लोइस" को निरंतर समर्थन प्रदान करने के लिए लाइफ फाउंडेशन का भी आभार व्यक्त करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well TC-treated plate Corning 353047
5 mL FACS tube  Corning 352054
50 mL Falcon tubes Greiner biomedica 227261
6-well TC-treated plate Corning 353046
7-AAD BD Biosciences 559925
BD FACS CANTO II BD Biosciences V96300084
BSA Applichem A1391
Cell Counter  Corning Cell Cytosmart J21E0081
Cryovials Greiner biomedica 122263
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2438
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) Life Technologies 14190
EDTA Invitrogen 15575-038
FACS Buffer (1x D-PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA) - -
FlowJo Software v10.6.2  TreeStar Inc -
Gibco CTS Opti-MEM I Medium ThermoFisher Scientific A4124801
GMP rhIL-15 Miltenyi Biotec 170-076-114
GMP rhIL-2 Miltenyi Biotec 170-076-146
GMP rhIL-7 Miltenyi Biotec 170-076-111
Hanks’s Balanced Salt Solution (HBSS) Life Technologies 14175
HEPA Whitley H35 Hypoxystation Don Whitley Scientific HA0315172H
Human Serum Albumin (HSA) Baxter B05AA01
Junior LB 9509 Portable Luminometer Berthold Technologies 6506
Lenti-X Provirus Quantitation Kit Takara Bio 631239
Lymphoprep Stemcell Technologies 7811
MACS GMP T cell TransAct Miltenyi Biotec 170-076-156
Mouse Anti-Human  CD3 (Clone: UCHT-1) BD Biosciences 557706
MycoAlert Plus Detection kit Lonza Bioscience LT07-703
Parafilm ultra-expandable closing film tape 5 cm x 75 m D.Dutscher 90261
PeriStem PS-650-DB (apheresis bag) Biomed Device SC00816
Planer Kryo10 Series III Planer
T75 flasks Greiner biomedica 658175
Trypan blue, 0.4% solution Invitrogen T10282
Vectofusin-1 GMP Miltenyi Biotec 170-076-165
X-VIVOTM 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Lonza Bioscience A1048501

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References

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जीएमपी-अनुरूप प्रक्रिया जीन-संशोधित टी कोशिकाएं दत्तक सेल थेरेपी आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाएं सीएआर-टी कोशिकाएं हेमटोलोगिक विकृतियां इन-हाउस विनिर्माण गुणवत्ता नियंत्रण आकलन राष्ट्रीय और अंतर्राष्ट्रीय नियामक एजेंसियां बड़े पैमाने पर वायरल वैक्टर टी सेल ट्रांसडक्शन प्रक्रिया लेंटीवायरल ट्रांसडक्शन प्राथमिक मानव टी कोशिकाएं फ्लोरोसेंट मार्कर जीन ऑफ इंटरेस्ट
जीन-संशोधित टी कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए एक जीएमपी-अनुरूप प्रक्रिया
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Savvopoulos, N., Stampolitis, K., Alexandropoulos, G., Kefala, D., Lysandrou, M., Zacharioudaki, V., Tsolakos, N., Spyridonidis, A. A GMP-Compliant Procedure for the Generation of Gene-Modified T cells. J. Vis. Exp. (200), e65097, doi:10.3791/65097 (2023).

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