인간 지방 유래 줄기 세포의 분리 및 배양 (Isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative Xenogeneic-free method for human therapy)
Summary
세포 치료제 준비/조작 단계에 도입된 이종(화학적 또는 동물 유래) 제품은 숙주 환자에서 면역 반응성 및 병원성 전파의 위험 증가와 관련이 있습니다. 여기서, 인간 지방유래 줄기세포의 분리 및 시험관내 확장을 위한 완전한 이종발생학적 무함유 방법이 기재되어 있다.
Abstract
줄기 세포 치료의 증가하는 영향을 고려할 때, 체외 조작 중 동물 유래 제품의 도입으로 인한 잠재적 오염 또는 감염 전파에 대한 생물학적 안전성 문제가 제기되었습니다. 세포 분리 및 확장 단계에서 일반적으로 사용되는 콜라게나제 또는 소 태아 혈청과 같은 이종 성분은 수용 환자의 면역 반응성 또는 바이러스, 박테리아 및 프리온 감염의 잠재적 위험과 관련될 수 있습니다. Good Manufacturing Practice 지침에 따라 화학적 조직 해리를 피해야 하며 소 태아 혈청(FBS)은 이종성이 없는 보충제로 대체할 수 있습니다. 또한, 셀 제품의 안전성을 보장하기 위해서는 보다 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방법의 정의가 중요합니다. 우리는 콜라겐 분해 효소 FBS 배양 표준 프로토콜과 비교하여 특성을 변경하지 않고 인간 지방 유래 줄기 세포의 분리 및 시험관 내 확장을 위한 혁신적이고 완전히 이종 발생이 없는 방법을 개발했습니다. 여기서, 복부 지방 조직으로부터 인간 지방유래 줄기세포(hASCs)를 분리하였다. 샘플을 가위/메스로 기계적으로 다진 후 미세 해부하고 10cm 페트리 접시에 기계적으로 분산시킨 다음 메스 절개로 준비하여 조직 조각의 부착과 hASC의 이동을 용이하게 했습니다. 세척 단계에 따라, hASC는 효소 소화 없이 소성 부착으로 인해 선택되었습니다. 분리된 hASC를 5% 헤파린이 없는 인간 혈소판 용해물이 보충된 배지로 배양하고 동물이 없는 트립신 대체물로 분리했습니다. 인간 치료용 세포 제품 생산에 대한 GMP(Good Manufacturing Practice) 지침에 따라 모든 배양 배지에 항생제를 사용하지 않았습니다.
Introduction
지난 수십 년 동안 혁신적인 치료법에 대한 수요가 증가함에 따라 중개 의학 분야에 상당한 노력과 자원 투자가 이루어졌습니다1. 세포 기반 제품은 세포 공급원, 제조 공정(분리, 확장 또는 유전자 변형) 및 비세포 보충제(효소, 성장 인자, 배양 보충제 및 항생제)에 의해 결정되는 위험과 관련이 있으며 이러한 위험 요소는 특정 치료 적응증에 따라 다릅니다. 최종 제품의 품질, 안전성 및 효능은 위에 명시된 요소2에 의해 크게 영향을 받을 수 있습니다. 줄기 세포 치료는 생물 안전 원칙을 준수해야합니다. 세포 배양에서 동물 유래 제품으로 인한 병원성 전파의 잠재적 위험은 문제가 될 수 있으며 제조에 도입된 모든 제품에 대한 철저한 테스트가 필수적입니다3.
인간 지방유래 줄기세포(hASC)를 분리하는 전통적인 방법은 콜라게나제(collagenase)를 이용한 효소 분해 후 원심분리를 통한 세척 단계를 거친다4. 효소 분리는 일반적으로 세포 수율 및 생존력 측면에서 다른 기계적 기술보다 더 효율적인 것으로 간주되지만, 콜라게나제와 같은 동물 유래 성분은 미국 식품의약국(FDA)에서 최소한으로 조작하는 것 이상으로 간주됩니다. 이는 면역 반응이나 질병 전파의 위험이 현저히 증가하여 hASC 요법의 임상 환경으로의 번역을 제한한다는것을 의미합니다 5,6.
트립신 기반 소화는 ASC를 분리하는 또 다른 효소 프로토콜입니다. 트립신 농도, 원심분리 속도 및 배양 시간 측면에서 약간의 수정을 가하여 다양한 기술이 설명되었습니다. 안타깝게도 이 방법은 잘 설명되어 있지 않으며, 문헌, 특히 기계적 격리 프로토콜7에 대한 비교가 부족하다. 그러나, 접근법의 번역 가능성의 관점에서, 트립신은 콜라게나제와 동일한 단점을 가지고 있습니다.
기계적 힘에 기초하고 효소를 첨가하지 않고 ASC를 얻기 위한 대체 분리 방법에는 지방 조직 조각의 고속 원심분리(800 x g 또는 1,280 x g, 15분)가 포함됩니다. 이어서, 펠렛을 적혈구 용해 완충액(5분)과 함께 인큐베이션한 후, 배양 배지에서 재현탁하기 전에 600 x g에서 또 다른 원심분리 단계를 거친다. 체외이식편 방법에 비해 첫 번째 날에 더 많은 수의 세포가 분리되었음에도 불구하고, 이전 연구에서는 배양 2주 이후에 증식이 더 낮거나 없는 것으로 나타났다8.
그 외에도, 세포 배양을 위한 성장 인자 보충제로 사용되는 소 태아 혈청(FBS)과 같은 이종 첨가 배지를 사용한 추가 조작은 숙주 환자의 면역 반응성 위험 증가 및 바이러스, 박테리아 또는 프리온 감염에 대한 노출과 관련이 있다 9,10. 면역 반응과 두드러기형 발진 발달은 FBS11로 생산된 중간엽 줄기 세포를 여러 번 투여받은 개인에서 이미 설명되었습니다. 또한, FBS는 배치-배치(batch-to-batch) 변동성을 가지며, 이는 최종 제품 품질에 영향을 미칠 수 있다12.
GMP(Good Manufacturing Practice) 지침에 따라 효소 조직 해리를 피해야 하며 FBS는 이종유전자가 없는 보충제로 대체해야 합니다. 이러한 단계들은 보다 신뢰할 수 있고 재현 가능한 프로토콜과 함께, 세포 치료제의 적용을 지원하는 데 필수적이다 3,13.
이러한 맥락에서, 인간 혈소판 용해물(hPL)은 무세포, 단백질 함유, 성장 인자 강화 보충제이기 때문에 FBS의 대체품으로 제안되어 왔으며, 시험관 내 세포 배양 및 확장을 위한 성장 배지의 첨가제로서 임상 등급 세포 기반 제품들 사이에 일찍이 도입되었다14,15. hPL은 인간 유래 제품이기 때문에 임상 적용을 위한 hASC의 체외 배양 중에 FBS의 대체물로 자주 사용되어 FBS 번역성과 관련된 면역학적 반응 및 감염과 관련된 문제를 줄입니다15,16.
더 높은 생산 비용에도 불구하고 FBS에 비해 hPL은 많은 세포 유형에 대한 세포 생존력을 지원하고, 증식을 증가시키고, 노화를 지연시키고, 게놈 안정성을 보장하고, 후기 세포 계대에서도 세포 면역 표현형을 보존한다는 것이 이미 입증되었습니다. 이러한 모든 요소는 이 문화 보충11로의 전환을 지원합니다.
이 연구의 목적은 기존의 FBS 배양 hASC와 비교하여 세포 생리학 및 줄기 특성을 수정하지 않고 완전한 동물 없는 방법으로 hASC를 분리 및 배양하는 표준화된 프로토콜을 개발하는 것이었습니다(그림 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
지방유래 줄기세포는 풍부함, 빠르고 저렴한 분리 방법, 높은 in vitro/in vivo 증식률 및 줄기/분화 특성으로 인해 지난 10년 동안 중개 연구의 관심을 끌었습니다18,19,20. 그 결과, hASC는 재생 의학에서 세포 기반 전략의 우수한 후보로 간주된다21. 지방 조직으로부터 분리된 후, hASC는 시험관 내에?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 인정하지 않습니다.
Materials
| 15 mL tubes | euroclone | et5015b | |
| anti-CD105 | BD Biosciences | BD560839 | |
| anti-CD34 | BD Biosciences | BD555821 | |
| anti-CD45 | BD Biosciences | BD555482 | |
| anti-CD73 | BD Biosciences | BD561254 | |
| autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer) | Miltenyi | 130-091-222 | |
| BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument) | BD accuri | – | |
| Burker chamber | Blaubrand | 717810 | |
| Cell freezing container | corning | CLS432002 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | |
| CoolCell Freezing container | Corning | CLS432002 | |
| Cryovials | clearline | 390701 | |
| Dimethyl sulfide | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| disposabile blade scalpel | paragon | bs 2982 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Human Platelet Lysate FD (GMP grade) | Stemulate | PL-NH-500 | |
| Infinite F50 spectrophotometer | Tecan | – | |
| Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives | Olympus | CKX41 | |
| Petri dish 10 cm | Greiner bio-one | 664160 | |
| Sterile scalpels | Reda | 07104-00 | |
| Sterile scissors | Bochem | 4071 | |
| Sterile tweezers | Bochem | 1152 | |
| Swinging bucket centrifuge | Sigma | 3-16K | |
| T25 flasks | Greiner bio-one | 6910170 | |
| TrypLe (animal free trypsin substitute) | GIBCO | 12604-013 |
Riferimenti
- Naderi, N., et al. The regenerative role of adipose-derived stem cells (ADSC) in plastic and reconstructive surgery. International Wound Journal. 14 (1), 112-124 (2017).
- Guiotto, M., Riehle, M. O., Raffoul, W., Hart, A., di Summa, P. G. Is human platelet lysate (hPL) the ideal candidate to substitute the foetal bovine serum for cell-therapy translational research. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 426 (2021).
- Condé-Green, A., et al. Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: Review of upcoming techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 4 (9), 1017 (2016).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Chang, H., et al. Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation. Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).
- Spees, J. L., et al. Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy. Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).
- Fadel, L., et al. Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep. Acta Cirurgica Brasileria. 26 (4), 267-273 (2011).
- Markarian, C. F., et al. Isolation of adipose-derived stem cells: A comparison among different methods. Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).
- Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Lalu, M. M., et al. Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells (SafeCell): A systematic review and meta-analysis of clinical trials. PLoS One. 7 (10), 47559 (2012).
- Escobar, C. H., Chaparro, O. Xeno-free extraction, culture, and cryopreservation of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 5 (3), 358-365 (2016).
- Vaidya, V., et al. Ultraviolet-C irradiation for inactivation of viruses in foetal bovine serum. Vaccine. 36 (29), 4215-4221 (2018).
- Kyllönen, L., et al. Effects of different serum conditions on osteogenic differentiation of human adipose stem cells in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4 (1), 17 (2013).
- Schallmoser, K., Henschler, R., Gabriel, C., Koh, M. B. C., Burnouf, T. Production and quality requirements of human platelet lysate: A position statement from the Working Party on Cellular Therapies of the International Society of Blood Transfusion. Trends in Biotechnology. 38 (1), 13-23 (2020).
- Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. Human platelet lysate to substitute fetal bovine serum in hMSC expansion for translational applications: A systematic review. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 351 (2020).
- Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. Human platelet lysate acts synergistically with laminin to improve the neurotrophic effect of human adipose-derived stem cells on primary neurons. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 658176 (2021).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Cowper, M., et al. Human platelet lysate as a functional substitute for fetal bovine serum in the culture of human adipose derived stromal/stem cells. Cells. 8 (7), 724 (2019).
- Kim, N., et al. Mesenchymal stem cells for the treatment and prevention of graft-versus-host disease: Experiments and practice. Annals of Hematology. 92 (10), 1295-1308 (2013).
- Palombella, S., et al. Effects of metal micro and nano-particles on hASCs: An in vitro model. Nanomaterials. 7 (8), 212 (2017).
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
- Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research. Stem Cells. 24 (5), 1409-1410 (2006).
- Perez-Ilzarbe, M., et al. Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy. Transfusion. 49 (9), 1901-1910 (2009).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells. Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).
- Becherucci, V., et al. Human platelet lysate in mesenchymal stromal cell expansion according to a GMP grade protocol: A cell factory experience. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 124 (2018).
- Blande, I. S., et al. Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate. Transfusion. 49 (12), 2680-2685 (2009).
- Castegnaro, S., et al. Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue. Current Stem Cell Research & Therapy. 6 (2), 105-114 (2011).
- Palombella, S., et al. Systematic review and meta-analysis on the use of human platelet lysate for mesenchymal stem cell cultures: Comparison with fetal bovine serum and considerations on the production protocol. Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 142 (2022).
- Palombella, S., et al. Human platelet lysate as a potential clinical-translatable supplement to support the neurotrophic properties of human adipose-derived stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 432 (2020).
- Krähenbühl, S. M., Grognuz, A., Michetti, M., Raffoul, W., Applegate, L. A. Enhancement of human adipose-derived stem cell expansion and stability for clinical use. International Journal of Stem Cell Research & Therapy. 2 (1), 007 (2015).
