Forstyrrelse af blod-rygmarvsbarrieren (BSCB) kan opnås med succes ved intravenøs administration af mikrobobler og anvendelse af lavintensitetsfokuseret ultralyd (LIFU). Denne protokol beskriver åbningen af BSCB ved hjælp af LIFU i en gnavermodel, herunder udstyrsopsætning, mikrobobleinjektion, mållokalisering og BSCB-forstyrrelsesvisualisering.
Lavintensitetsfokuseret ultralyd (LIFU) bruger ultralydpulsationer ved lavere intensiteter end ultralyd og testes som en reversibel og præcis neuromodulerende teknologi. Selvom LIFU-medieret blod-hjerne-barriere (BBB) åbning er blevet undersøgt i detaljer, er der ikke etableret nogen standardiseret teknik til åbning af blod-rygmarvsbarriere (BSCB) til dato. Derfor præsenterer denne protokol en metode til vellykket BSCB-forstyrrelse ved hjælp af LIFU-sonikering i en rottemodel, herunder beskrivelser af dyreforberedelse, mikrobobleadministration, målvalg og lokalisering samt BSCB-forstyrrelsesvisualisering og bekræftelse. Den tilgang, der rapporteres her, er især nyttig for forskere, der har brug for en hurtig og omkostningseffektiv metode til at teste og bekræfte mållokalisering og præcis BSCB-forstyrrelse i en lille dyremodel med en fokuseret ultralydstransducer, evaluere BSCB-effekten af sonikeringsparametre eller udforske applikationer til LIFU ved rygmarven, såsom lægemiddelafgivelse, immunmodulation og neuromodulation. Det anbefales at optimere denne protokol til individuel brug, især for at fremme fremtidigt præklinisk, klinisk og translationelt arbejde.
I lighed med blod-hjerne-barrieren (BBB) regulerer blod-rygmarvsbarrieren (BSCB) bevægelsen af cirkulerende opløste stoffer, celler og plasmakomponenter ind i spinal parenchyma1. Denne beskyttende funktion er resultatet af et specialiseret system af tæt bundne, ikke-fenestrerede endotelceller, der forer rygsøjlekapillærerne2. Typisk kan kun lipofile molekyler med lav vægt med en positiv ladning krydse begge barrierer3. På trods af undersøgelser, der tyder på, at BSCB har en lidt højere permeabilitet end BBB, begrænser begge barrierer leveringen af terapi til centralnervesystemet4. Flere strategier er blevet udviklet for at øge transporten af lægemidler på tværs af BSCB, herunder teknikker til at øge det osmotiske tryk i rygsøjlen, udviklingen af lægemidler, der interagerer med bradykininreceptorer og oprettelsen af funktionaliserede nanopartikler5.
BSCB-forstyrrelse kan også opnås via intravenøs administration af mikrobobler (MB’er) efterfulgt af lavintensitetsfokuseret ultralyd (LIFU) sonikering6. Det akustiske felt, der genereres af ultralydstransduceren, forårsager MB-svingninger, som igen anvender stress mod endotelvæggen og løsner tætte kryds7. Den stramme krydsløsning skaber forbigående huller i kapillærerne, hvilket gør det muligt for terapi at trænge ind i spinal parenchyma (figur 1). Denne proces kan også skabe transendotelfenestrationer, øge transcytose og nedregulere ATP-bindende kassettetransportører, såsom P-glycoprotein 8,9. En vigtig fordel ved denne teknik er evnen til at minimere off-target effekter ved at lede fokalområdet af sonikering til placeringen af interesse i rygmarven. Flere kliniske forsøg har undersøgt effekten af LIFU-medieret BBB-åbning til behandling af patologier i centralnervesystemet, herunder gliomer, amyotrofisk lateral sklerose, Alzheimers sygdom og Parkinsons sygdom. Selvom LIFU-medieret BSCB-forstyrrelse ikke er så omfattende karakteriseret som LIFU-medieret BBB-forstyrrelse, har flere grupper rapporteret vellykket BSCB-forstyrrelse i gnaver-, kanin- og svinemodeller10,11,12. Samlet set vokser interessen for teknikken hurtigt, især som en levedygtig vej til lægemiddellevering.
I denne protokol beskrives en teknik til LIFU-medieret BSCB-forstyrrelse i en rottemodel. Proceduren omfatter detaljerede beskrivelser af dyreforberedelse, opsætning af LIFU-udstyr, MB-administration, mållokalisering og rygmarvsekstraktion. Bekræftelse af mållokalisering og BSCB-forstyrrelse evalueres via Evans blå farvestof (EBD) ekstravasation i rygmarven. EBD er en ikke-toksisk forbindelse, der binder til serumalbumin og kan identificeres ved sin rige blå farve visuelt og rød autofluorescens under mikroskopi13.
De trin, der er anført her, tilbyder et hurtigt og billigt alternativ til traditionelle ultralyd (US) eller magnetisk resonans (MR) -guidede LIFU-systemer. Som et resultat er denne metode nyttig for forskere, der er interesserede i hurtigt at teste og bekræfte målretnings- og BSCB-forstyrrelsesfunktionerne i deres LIFU-transducer, før de erhverver yderligere udstyr og materialer eller forfølger LIFU-applikationer ved rygmarven, såsom lægemiddelafgivelse, immunmodulation og neuromodulation.
Her beskrives det udstyr og de trin, der kræves til effektiv og målrettet BSCB-forstyrrelse ved hjælp af lavintensitetsfokuseret ultralyd (LIFU) kombineret med mikroboble (MB) administration. Denne protokol er fleksibel og kan optimeres til individuel brug med transducere med forskellige specifikationer. Andre teknikker til LIFU-medieret BSCB-forstyrrelse er afhængige af brugen af magnetisk resonansbilleddannelse (MRI)-styrede systemer til mållokalisering, hvilket er en dyr ressource16. Fordelene ved teknikken, der præsenteres her, ligger i den hurtige visuelle bekræftelse i realtid af BSCB-forstyrrelse og den lette målretning på grund af procedurens åbne karakter. Desuden er laserapparatet enkelt at bruge og konstruere, og en CAD-fil er inkluderet i det supplerende afsnit. Som følge heraf kan forskere, der er interesserede i at udføre indledende tests af målretningsmulighederne for deres LIFU-transducer i en lille dyremodel, bruge denne protokol som et værktøj til hurtigt at bekræfte fokuszonepositionering over et sted af interesse. Denne teknik kan også bruges af laboratorier, der begynder at studere kliniske anvendelser af LIFU, såsom lægemiddelafgivelse, før de investerer i mere komplekse vejledningsmetoder som amerikanske eller MR-systemer. I øjeblikket præsenterer USA-styrede modaliteter en mere lovende og omkostningseffektiv vej sammenlignet med MR-systemer, selvom sidstnævnte hyppigere ses i litteraturen.
Der er flere kritiske trin i denne procedure, der skal udføres omhyggeligt for at sikre en vellykket BSCB-forstyrrelse. Det er bydende nødvendigt at undgå at lægge unødvendigt pres på rygmarven under den kirurgiske laminektomi. For meget fysisk manipulation af ledningen øger sandsynligheden for skade på BSCB. Skader vises som en mørkebrun plet inde i ledningen efter ekstraktion på grund af blødning og øget EBD-ekstravasation. Desuden skal der sikres maksimal kobling mellem transduceren og den eksponerede rygmarv. Som følge heraf skal man sørge for at fjerne bobler fra vandkeglen og ultralydgelen. Der bør ikke være mellemrum mellem bunden af vandkeglen og ledningen for at sikre fuld transmission af den akustiske bølge. Under halevenekateteriseringen bør man undgå ved et uheld at passere luft sammen med de hepariniserede saltvands-, EBD- eller MB-opløsninger. Injektion af luft øger i høj grad chancen for en lungeemboli, der resulterer i gnaverdød inden afslutningen af proceduren28.
Et almindeligt problem, der kan opstå under denne procedure, er manglende vellykket EBD-injektion. For personer med minimal erfaring i halevenekateterisering sparer det tid at udføre dette trin før dyrelaminektomi, positionering eller målretning. EBD kan også injiceres godt før MB injektion uden at påvirke sonikering. Brug af turnering og varmt vandbad, der foreslås i denne protokol, hjælper med at udvide halevenerne og øge succesraten. Desuden reducerer dehydrering af rotter sandsynligheden for korrekt kateterplacering. En intraperitoneal saltvandsinjektion 10-15 minutter før halevenekateterisering kan hjælpe. Under kateteriseringen skal man starte 2 ind over enden af halen og bevæge sig i en kaudal til kranial retning. At bevæge sig i modsat retning mindsker sandsynligheden for succes på grund af potentiel venekollaps eller blødning.
En anden almindelig udfordring indebærer manglen på EBD ekstravasation på trods af sonikering. Dette kan indikere, at de parametre, der anvendes til sonikering, er utilstrækkelige til BSCB-forstyrrelse. For eksempel, hvis sonikeringsfrekvensen er indstillet til en værdi, der adskiller sig meget fra transducerens centrale frekvens, vil sonikeringseffekten være for lav til at svinge MB’er og forårsage tæt krydsløsning. Desuden jo flere grænseflader mellem transduceren og ledningen (f.eks. Vandkegle, membran, gel, luftbobler i vand / gel), jo lavere vil den sande sonikeringsintensitet være ved målet. Minimering af disse grænseflader, såsom ved hjælp af afgasset gel og grundigt fjernelse af bobler inde i keglen, vil hjælpe med at overføre det fulde potentiale af sonikeringen. Protokollen tilskynder også til at øge tiden mellem sonikering og perfusion for at give mere tid til EBD-ekstravasation i spinal parenchyma. Selvom BSCB-forstyrrelse er en forbigående procedure, er hullerne til stede i flere timer, før de lukkes. En lang ventetid øger eksponeringen for isofluran, men resulterer også i større EBD-ekstravasation i ledningen. Alternativt kan EBD ekstravasation være til stede på trods af ingen sonikering med LIFU. For at fejlfinde dette problem skal der udvises forsigtighed under laminektomien for at forhindre utilsigtet skade på BSCB. Potentielle løsninger omfatter løft af rotterygsøjlen under fastspænding for at øge mængden af plads mellem lamine og ledning samt en kortere laminektomi. En grundig PFA-perfusion reducerer også baggrundsfarvning ved at fjerne EBD-beriget blod fra vaskulaturen i rygmarven. Under transkardieperfusionen skal man sørge for at forhindre utilsigtet brud på hjertet, hvilket kan resultere i lækage af PBS eller PFA.
Det er vigtigt at bemærke, at denne undersøgelse repræsenterer en enkelt centeroplevelse for LIFU-medieret BSCB-forstyrrelse. Desuden tester eller optimerer denne protokol ikke forskellige sonikeringsenergiparametre og MB-koncentrationer. Som følge heraf opfordres forskere til at undersøge forskellige parametre og koncentrationer, når de udfører denne teknik for at optimere mållokalisering og BSCB-forstyrrelse til deres særlige forskningsbehov, især hvis de første resultater giver negative virkninger. Grupper, der gerne vil se ingen temperaturændringer, kan for eksempel teste forskellige parametre, indtil de finder et sæt, der opfylder dette kriterium og opnår tilstrækkelig BSCB-forstyrrelse. Desuden kan yderligere eksperimenter udføres for at bekræfte sikkerheden ved denne teknik. For eksempel kan prøvestørrelser øges, overlevelsesperioden kan forlænges, og elektromyografi / ganganalyseundersøgelser kan udføres. For længere overlevelser er det vigtigt at huske på, at nogle undersøgelser viser, at høje doser EBD undertiden kan forårsage kronisk systemisk toksicitet, så en lavere dosis kan være forsigtig29.
En anden begrænsning af denne procedure er den invasive karakter af laminektomien (som er nødvendig for enhver teknik, der bruger LIFU til BSCB-åbning, da ultralyd ikke kan trænge gennem knoglen). Den invasive karakter af denne procedure kan reduceres ved at begrænse længden af laminektomi. Udførelse af laminektomi i de øvre brysthvirvler, som er kortere og tyndere, kan reducere den tid, der er nødvendig for laminektomi til under 10 minutter. På grund af MB’ernes skrøbelige karakter samt deres korte halveringstid er tiden begrænset under denne protokol. Injektionen af MB’er skal ske 1-2 minutter før behandling med LIFU, og nye MB’er skal administreres før hver sonikering, hvis der udføres flere LIFU-behandlinger. For forsøg, der involverer BSCB-forstyrrelse for flere rotter, kan det være nødvendigt at klargøre flere MB hætteglas. Da mikrobobler er dyre, foretrækkes ændring af den kirurgiske arbejdsgang for at minimere tiden mellem sonikeringer for at bevare antallet af anvendte MB’er.
Teknikken beskrevet her er primært til brug som en forskningsprotokol. Selvom lasermålretningsapparatet ikke erstatter traditionelle målretningsmetoder i alle kliniske indstillinger, kan det være nyttigt i andre situationer. Til ikke-invasive operationer kan traditionelle MR-modaliteter pålideligt bruges til målretningmod 30. For invasive operationer, der omfatter en laminektomi, der udføres, kan laserpunktapparatet beskrevet i denne protokol bruges til hurtigt at lokalisere midten af fokalzonen for sonikering over en bestemt region (for eksempel en tumor eller et sted for rygmarvsskade) med henblik på lægemiddelafgivelse eller immunmodulerende terapi, samtidig med at der suppleres enhver MR-vejledning, der ville finde sted.
Samlet set beskriver denne protokol en effektiv og vellykket teknik til BSCB-forstyrrelse og indeholder flere muligheder for bekræftelse af BSCB-åbningen, både i realtid og efterbehandling. Da BSCB fungerer som en barriere for adgang til rygmarvsparenchymen, er forstyrrelse af BSCB en mulig metode til at forbedre leveringen af terapi. For eksempel brugte Weber-Adrian et al. LIFU med en frekvens på 1,114 MHz og burstlængde på 10 ms til at formidle genlevering til cervikal rygsøjlen6. Tilsvarende viste Smith et al., at LIFU med en frekvens på 580 kHz, gennemsnitlige akustiske toptryk omkring 0,46 MPa og en sprænglængde på 10 ms kunne hjælpe med levering af et monoklonalt antistof, trastuzumab, til rygmarven i en gnavermodel af leptomeningeale metastaser10. De fleste undersøgelser har fokuseret på at udnytte LIFU, snarere end HIFU på grund af LIFUs evne til forbigående permeabilisering af BSCB og samtidig undgå skade på det underliggende væv. LIFU bruger typisk intensiteter mellem 0,125-3 W/cm2, mens HIFU bruger intensiteter fra 100-10.000 W/cm2 eller højere31. Som et resultat udøver HIFU sine virkninger primært gennem opvarmning af væv, mens LIFU med samtidig administration af MB’er virker gennem mekaniske kavitationseffekter. Samtidig administration af terapi med MB’er kan resultere i større ekstravasation af lægemidlet i spinal parenchyma, samt potentialet til at indlæse MB’er med lægemiddel og lyse MB’erne med ultralyd til målrettet lægemiddelafgivelse.
Sonikeringsparametrene, MB-koncentrationen og typen af transducer, der anvendes i denne undersøgelse, kan ændres baseret på eksperimentelle behov. For eksempel kan en transducer med et mindre fokusområde være at foretrække til eksperimenter, hvor der er behov for større kontrol over lokaliseret målretning, mens en transducer med højere effekt kan bruges til eksperimenter, der kræver kraftig forstyrrelse på kortere tid. På grund af den fleksibilitet, som denne protokol tilbyder, er der et stort potentiale for anvendelse i præklinisk, klinisk og translationel forskning.
The authors have nothing to disclose.
Støttet af T32GM136577 (D.R.); N660012024075 (N.T., N.V.T., A.M., K.K.L.); R01 HL139158-01A1 og R01 HL071568-15 (NVT) Johns Hopkins ICTR Clinical Research Scholars Program (KL2) (AM). Flere figurer skabt med BioRender.com.
0.9% Heparinized Sodium Chloride | Baxter | FKB0953G | Flush tail vein catheter with heparinized saline to prevent clotting. |
100 mL Luer Lock Tip Syringe (2) | Wilburn Medical | WUSA/120 | One syringe can be used to inject PBS and one for PFA (during transcardial perfusion) |
1x Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Scientific | 10010001 | For transcardial perfusion. |
22 G catheter | Med Vet International | 50-209-1694 | Use to place a tail vein catheter. |
97% Isoflurane | Thermo Scientific Chemicals | 247-897-7 | While rat is under isoflurane, be careful not to administer too much. A high dose can euthanize the rat. |
Betadine 7.5% | Purdue Products | 4677 | |
Class A clear threaded glass vial | Fisherbrand | 14-955-314 | Use to store spinal cord extraction. |
Digital balance scale | Kent Scientific | SCL-4000 | |
Electric razor | Wahl Home Products | 79449-200 | Shave fur off skin at incision site before surgery |
Eosin-Y with Phloxine | Epredia | 71304 | |
Evans blue dye | MP Biomedicals | 02151108-CF | Although it is non-toxic, it will stain skin blue if direct contact occurs. |
Fixation Plate Assembly with 0.5 mm Forceps | PSI Impactors | 7001-2 | Affix the stereotactic arm to this frame |
Gauze | Fisherbrand | 13-761-52 | |
Heating pad | Kent Scientific | RT-0515 | |
Hematoxylin | Epredia | 7211 | |
Iris Scissors with Angled Blades | ProDentUSA | 12-15315 | |
Isoflurane induction system | Kent Scientific | SOMNO-RATKIT | |
Laser targetting apparatus | NA | custom | CAD design file provided in supplemental section. Simply place a laser inside the apparatus created from the file. |
Lubricating eye ointment | Systane | N/A | |
Luer Lock 3-Way Stopcock | Sigma | SAS7521-10EA | Can use to fill water cone through inlet valve |
Lumason microbubbles kit | Bracco | 0270-7099-16 | |
Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-545J | |
Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
Microtome | Epredia | 23-900-671 | |
Mounting medium with 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-2000-2 | |
Mylar membrane | Chemplex | 3016 | Can cut membrane to appropriate size if too large for cone |
NeuroFUS 2.52" diameter 250 kHz transducer | Sonic Concepts | CTX-250 | Transducer system includes custom water cone and probe holder |
NeuroFUS PRO v2.0 system | Sonic Concepts | NFS102v2 | Includes Transducer Power Output, Matching Network and associated cables |
Offset Bone Nippers | Fine Science Tools | 16101-10 | Use to remove spinous processes and laminae for laminectomy |
Paraffin | Polysciences | 24364-1 | Can place spinal cord sample in paraffin to slice into thin sections for histology. |
Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J61899-AK | For transcardial perfusion. |
Rat Surgical Kit | Kent Scientific | INSRATKIT | Consists of tweezer #5, needle holder, McPherson-Vannas scissors, Iris scissors, ALM self-retaining retractors, Iris forceps, and blunt probe. These products should be sufficient to perform a laminectomy. |
Razor blade | Fisherbrand | 12-640 | Use to cut spinal cord extraction to desirable length and split section down midline. |
Rectal thermometer | Kent Scientific | RET-2 | Maintain rat temperature between 35.9–37.5 °C |
Rubber band | Fisherbrand | 50-205-1983 | |
Single animal vaporizer unit | Kent Scientific | SF-01 | |
Stereotactic arm | Kopf Instruments | Model 963 | |
Sterile absorbent pad | McKesson | 4033-CS150 | Place under rat and above heating pad and fixation plate before laminectomy |
Ultrasound gel | Aquasonic | PLI 01-34 | Ensure gel is free of bubbles to the best of your ability. |