Her præsenterer vi en protokol til brug af et high-throughput system, der muliggør overvågning og kvantificering af de neuromodulerende virkninger af fokuseret ultralyd på menneskeinducerede pluripotente stamcelle (HiPSC) neuroner.
De neuromodulerende virkninger af fokuseret ultralyd (FUS) er blevet påvist i dyremodeller, og FUS er blevet anvendt med succes til behandling af bevægelse og psykiatriske lidelser hos mennesker. På trods af succesen med FUS forbliver mekanismen, der ligger til grund for dens virkninger på neuroner, dårligt forstået, hvilket gør behandlingsoptimering ved at indstille FUS-parametre vanskelig. For at afhjælpe dette hul i viden studerede vi humane neuroner in vitro ved hjælp af neuroner dyrket fra menneskeskabte pluripotente stamceller (HiPSC’er). Brug af HiPSC’er giver mulighed for undersøgelse af menneskespecifik neuronal adfærd i både fysiologiske og patologiske tilstande. Denne rapport præsenterer en protokol til brug af et high-throughput system, der muliggør overvågning og kvantificering af de neuromodulerende virkninger af FUS på HiPSC-neuroner. Ved at variere FUS-parametrene og manipulere HiPSC-neuronerne gennem farmaceutiske og genetiske modifikationer kan forskere evaluere de neurale reaktioner og belyse de neuromodulerende virkninger af FUS på HiPSC-neuroner. Denne forskning kan have betydelige konsekvenser for udviklingen af sikre og effektive FUS-baserede terapier til en række neurologiske og psykiatriske lidelser.
Fokuseret ultralyd (FUS) er en lovende neuromodulationsmodalitet, der muliggør ikke-invasiv stimulering på centimeterniveau dybder med submillimeteropløsning 1,2,3. På trods af disse styrker er den kliniske virkning af FUS begrænset, delvis på grund af manglende viden om dens virkningsmekanisme. Uden et solidt teoretisk fundament står forskere og klinikere over for vanskeligheder med at skræddersy terapien til at imødekomme de specifikke behov hos individuelle patienter under forskellige forhold. En fremtrædende teori foreslået af Yoo et al.4 antyder, at mekanofølsomme ionkanaler er ansvarlige for neuronaktivering. Denne teori forklarer imidlertid ikke FUS-aktivering i menneskelige hjerneneuroner, som mangler disse kanaler5. Denne tvetydighed begrænser udnyttelsen af FUS i klinikken, da det udelukker indstilling af FUS-parametre for at optimere behandlingsresultater.
Tidligere relaterede undersøgelser har anvendt en række tilgange til at undersøge de fysiologiske mekanismer, der understøtter FUS og til at bestemme de optimale stimuleringsparametre. Et afgørende trin i denne proces involverer overvågning af neuronale reaktioner som feedback, hvilket kan opnås gennem metoder, der involverer ion-gate-overvågning, såsom calciumionbilleddannelse4, optisk billeddannelse1 og ex vivo elektrofysiologisk optagelse (f.eks. elektromyografi6 eller hud-nerve elektrofysiologi7). Imidlertid bruger de fleste af disse undersøgelser ikke-menneskelige neuroner eller in vivo-tilgange, som kan introducere yderligere varians på grund af suboptimale kontroller. I modsætning hertil giver brug af elektroder til måling af neuronale signaler i in vitro menneskeinducerede pluripotente stamcelleneuroner (HiPSC) mere følsomme målinger og større kontrol over det eksperimentelle miljø. I dette arbejde er der udviklet et in vitro-system ved hjælp af mikroelektrodearrays (MEA’er) til måling af de elektriske reaktioner af HiPSC-neuroner efter FUS-stimulering, som vist i figur 1. Dette system giver forskere i samfundet mulighed for at overvåge neuronale reaktioner, når de varierer ultralydsparametrene (f.eks. Frekvens, burstlængde, intensitet). Derudover muliggør dette system et højt niveau af kontrol af neuronal følsomhed over for fysiske stimuli (f.eks. temperatur, tryk og kavitation)8,9, da neuronernes ionkanalfunktionalitet kan manipuleres genetisk og farmaceutisk (f.eks. ved hjælp af gadolinium til at hæmme ionkanaler)10,11,12. Denne kontrol på molekylært niveau kan bidrage til at belyse mekanismerne bag de neuromodulerende virkninger af FUS.
Dette manuskript beskriver en ny metode, der kan bruges til at registrere neuronal aktivitet i HiPSC’er under FUS-neuromodulation. Denne protokol kan generaliseres til forskellige FUS-transducere og MEA-systemer. For at replikere de resultater, der observeres med den beskrevne protokol, skal forskeren sikre, at transducerens fokuspunkt er større end arealet af bunden af MEA-brønden. Hvis der anvendes forskellige neuronale cellelinjer, skal filterparametrene desuden indstilles til det forventede frekvensrespons for cellerne i brønden. Hvis der ikke kan opnås repræsentative resultater, bør man overveje at ændre ovennævnte parametre (f.eks. sprænglængde, intensitet, driftscyklus osv.).
Selvom dette arbejde viste en stigning i affyringshastigheden efter FUS-stimulering, skal der indsamles flere data for at demonstrere repeterbarheden af dette fund, før der drages nogen konklusioner. Denne protokol arver begrænsningerne ved MEA-systemer, som typisk har svagheder, der stammer fra den direkte mikroelektrodestrømsignaloptagelse. Selvom direkte kontakt med neuronen giver bedre følsomhed, kan det ændre cellen og påvirke målenøjagtigheden. På grund af brøndenes lille størrelse inkluderer vores system desuden ikke perifert væv, som også kan spille en rolle i neuromodulation17. Dette kan begrænse anvendeligheden af konklusioner fra denne opsætning på in vivo-miljøer . For at studere mere komplekse netværksresponser skal et MEA-system med højere kanaltæthed designes til at forbedre dets følsomhed18. Flere fremtidige retninger for dette foreslåede system er blevet identificeret, herunder brug af en 3D-portal til at holde transduceren og sikre nøjagtig placering19. Yderligere forbedringer kunne foretages med hensyn til efterbehandlingsalgoritmen, herunder anvendelse af en spiking sorteringsalgoritme20 til at klassificere individuelle neuroner. Denne proces ville være gavnlig for at adskille reaktionerne fra multi-unit neuroner i fremtidige undersøgelser af mekanismerne i FUS. Vigtigst er det vigtigt at indarbejde yderligere stimuleringsmetoder, såsom kemiske, elektriske og optiske stimuli, for at belyse de underliggende mekanismer. Disse metoder kan ændre neuronale egenskaber og adfærd, såsom ved at hæmme specifikke ionkanaler15 eller ændre membranegenskaberne21. Ved at modulere de vigtigste faktorer inden for den hypotetiske signalvej kan forskere identificere bidragene fra hver faktor i kontrollerede miljøer og i sidste ende kaste lys over de komplekse interaktioner, der er på spil.
Elektrisk stimulering22 er en af de mest etablerede teknikker til neuromodulation med en lang historie med vellykkede anvendelser i kliniske og forskningsmæssige omgivelser. I modsætning hertil er FUS og optogenetik23 relativt nye modaliteter, der har fået opmærksomhed i de senere år. De største fordele ved FUS er dets ikke-invasivitet og evne til at stimulere neuroner på dybder, der kan være vanskelige at nå med andre teknikker, herunder elektrisk stimulering og optogenetik. Men ligesom optogenetik24 har FUS nogle begrænsninger relateret til modellering af bølgeudbredelsen og tilhørende neuronale reaktioner. At fange kompleksiteten af vævets heterogene akustiske egenskaber in vivo kan være udfordrende, hvilket fører til usikkerheder i trykfeltet og følgelig i neuronresponserne. Denne vanskelighed ved nøjagtigt at modellere disse egenskaber udgør en udfordring, når teknikken optimeres til specifikke applikationer i den virkelige verden. De iboende kompleksiteter understreger vigtigheden af in vitro-systemer som det i denne undersøgelse, da de muliggør direkte undersøgelse af responser under kontrollerede akustiske intensitetsforhold.
Afslutningsvis giver dette system en høj gennemstrømning, in vitro platform til undersøgelse af de neuromodulerende virkninger af FUS på humane neuroner. Med dette system kan virkningsmekanismerne for FUS udforskes ved at måle de elektriske reaktioner fra menneskelige neuroner, når de udsættes for forskellige niveauer og typer stimulering i et kontrolleret miljø. Derfor tilbyder det et værdifuldt supplerende værktøj til de menneske- og dyremodeller, der almindeligvis anvendes i marken.
The authors have nothing to disclose.
Amir Manbachi og Nitish Thakor anerkender finansieringsstøtte fra Defense Advanced Research Projects Agency, DARPA, Award Contract: N660012024075. Derudover anerkender Amir Manbachi finansieringsstøtte fra Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research (ICTR)’s Clinical Research Scholars Program (KL2), administreret af National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS), National Institutes of Health (NIH). Nitish Thakor anerkender finansieringsstøtte fra National Institutes of Health (NIH): R01 HL139158-01A1 og R01 HL071568-15.
MEA System | Axion Biosystem Inc. | Maestro Edge | Sampling Rate: 11500 Hz |
MEA Plate | Axion Biosystem Inc. | CytoView MEA | Electrode and Well: 16 electrodes in 24 wells |
Well plate Interface | Amcor Inc. | Parafilm PM996; P7793 | Thickness: 127 µm |
CO2 Tank and Regulator for culture | AirGas Inc./ Harris Inc. | 9296NC | Concentration: 5% |
Culture Media | ThermoFisher Inc. | Laminin; 23017-015 | Concentration: 1 µg/mL |
HiPSC Neurons | Peprotech | CIPS and GM01582 Derived; 450-10 | Concentration: 10 ng/mL (Refer Taga et al [2021]13) |
Transducer | Sonic Concepts Inc. | CTX250; 008 | Center Frequency: 250 kHz |
Matching Network | Sonic Concepts Inc. | CTX250; NFS102v2 | Impedance: 50 Ω |
Transducer Power Output (TPO) | Sonic Concepts Inc. | Version 4.1; 020 | Frequency: From 250 kHz to 2.5 MHz |
Membrane | McMaster Inc. | Silicone Rubber; 5542N115 | Thickness: 0.0127 cm |
Coupling Gel | Parker Laboratory Inc. | Aquasonic 100; B08DDWG GXB | Viscosity: 130,000–185,000 cops |
Connection to Probe holder | McMaster Inc. | Steal Threaded Rod; 90322A661 | Length: 1–1/2" Long |
Centrifuge | ThermoFisher Inc. | Sorvall Legend X1R; 75004261 | Max acceleration: 10–25,830 x g |
Hydrophone | Sonic Concepts Inc. | Y-104; 009 | Range: 50 kHz–1.9 MHz |
Water Tank | Sonic Concepts Inc. | WT | Size: 30 cm x 30 cm x 30 cm |
Water Conditioning Unit | Sonic Concepts Inc. | WCU; SN006 | Flow Velocity: 50 mL/s maximum |
Oscilloscope | Rohde-Schwarz Inc. | RTC1002 | Sampling rate: Up to 50 MHz |
Stage | Sonic Concepts Inc. | MicroStage; 2 | Accuracy: 1 µm |
Thermochromic sheet | TIPTEMP Inc. | Liquid Crystal Sheet; TLCSEN337 | Range: 22–24 °C |
Computer | Microsoft Surface | Surface Pro | CPU i5 1035G4: 3.7 GHz |
Data Transfer Software | Mathworks Inc. | MATLAB | Version 2021b |
Processing Software | Python Software Foundation | Python | Version 3.7.10 |