यहां, हम एक उच्च-थ्रूपुट सिस्टम का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (HiPSC) न्यूरॉन्स पर केंद्रित अल्ट्रासाउंड के न्यूरोमॉड्यूलेटरी प्रभावों की निगरानी और मात्रा का ठहराव को सक्षम बनाता है।
केंद्रित अल्ट्रासाउंड (एफयूएस) के न्यूरोमॉड्यूलेटरी प्रभावों को पशु मॉडल में प्रदर्शित किया गया है, और मनुष्यों में आंदोलन और मनोरोग विकारों के इलाज के लिए एफयूएस का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। हालांकि, एफयूएस की सफलता के बावजूद, न्यूरॉन्स पर इसके प्रभावों को अंतर्निहित तंत्र खराब समझा जाता है, जिससे एफयूएस मापदंडों को ट्यून करके उपचार अनुकूलन मुश्किल हो जाता है। ज्ञान में इस अंतर को दूर करने के लिए, हमने मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) से सुसंस्कृत न्यूरॉन्स का उपयोग करके इन विट्रो में मानव न्यूरॉन्स का अध्ययन किया। HiPSCs का उपयोग दोनों शारीरिक और रोग राज्यों में मानव विशिष्ट neuronal व्यवहार के अध्ययन के लिए अनुमति देता है. यह रिपोर्ट एक उच्च-थ्रूपुट प्रणाली का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करती है जो HiPSC न्यूरॉन्स पर FUS के न्यूरोमॉड्यूलेटरी प्रभावों की निगरानी और मात्रा का ठहराव को सक्षम बनाती है। FUS मापदंडों अलग-अलग और दवा और आनुवंशिक संशोधनों के माध्यम से HiPSC न्यूरॉन्स में हेरफेर करके, शोधकर्ता तंत्रिका प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन कर सकते हैं और HiPSC न्यूरॉन्स पर FUS के न्यूरो-मॉड्यूलेटरी प्रभावों को स्पष्ट कर सकते हैं। इस शोध में न्यूरोलॉजिकल और मनोरोग विकारों की एक श्रृंखला के लिए सुरक्षित और प्रभावी एफयूएस-आधारित उपचारों के विकास के लिए महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकते हैं।
फोकस्ड अल्ट्रासाउंड (एफयूएस) एक आशाजनक न्यूरोमॉड्यूलेशन मोडेलिटी है जो उप-मिलीमीटर रिज़ॉल्यूशन 1,2,3 के साथ सेंटीमीटर-स्तर की गहराई पर गैर-इनवेसिव उत्तेजना को सक्षम बनाता है। इन शक्तियों के बावजूद, FUS का नैदानिक प्रभाव सीमित है, आंशिक रूप से इसकी क्रिया के तंत्र के बारे में ज्ञान की कमी के कारण। एक ठोस सैद्धांतिक नींव के बिना, शोधकर्ताओं और चिकित्सकों को अलग-अलग परिस्थितियों में व्यक्तिगत रोगियों की विशिष्ट आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए चिकित्सा को तैयार करने में कठिनाइयों का सामना करना पड़ता है। यू एट अल 4 द्वारा प्रस्तावित एक प्रमुख सिद्धांत से पता चलता है कि न्यूरॉन सक्रियण के लिए मैकेनोसेंसिटिव आयन चैनल जिम्मेदार हैं। हालांकि, यह सिद्धांत मानव मस्तिष्क न्यूरॉन्स में एफयूएस सक्रियण की व्याख्या करने में विफल रहता है, जिसमें इन चैनलोंकी कमी होती है। यह अस्पष्टता क्लिनिक में FUS के उपयोग को सीमित करती है, क्योंकि यह उपचार परिणामों को अनुकूलित करने के लिए FUS मापदंडों की ट्यूनिंग को रोकती है।
पूर्व संबंधित अध्ययनों ने एफयूएस को कम करने वाले शारीरिक तंत्र की जांच करने और इष्टतम उत्तेजना मापदंडों को निर्धारित करने के लिए कई दृष्टिकोणों को नियोजित किया है। इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम प्रतिक्रिया के रूप में न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं की निगरानी शामिल है, जो आयन-गेट निगरानी से जुड़े तरीकों के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, जैसे कैल्शियम आयन इमेजिंग4, ऑप्टिकल इमेजिंग1, और पूर्व विवो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग (जैसे, इलेक्ट्रोमोग्राफी6 या त्वचा-तंत्रिका इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी7)। हालांकि, इनमें से अधिकांश अध्ययन गैर-मानव न्यूरॉन्स या विवो दृष्टिकोण में उपयोग करते हैं, जो उप-इष्टतम नियंत्रणों के कारण अतिरिक्त विचरण पेश कर सकते हैं। इसके विपरीत, इलेक्ट्रोड का उपयोग इन विट्रो मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल में न्यूरोनल संकेतों को मापने के लिए (HiPSC) न्यूरॉन्स अधिक संवेदनशील माप और प्रयोगात्मक वातावरण पर अधिक से अधिक नियंत्रण प्रदान करता है. इस काम में, एक इन विट्रो प्रणाली सूक्ष्म इलेक्ट्रोड सरणियों (विदेश मंत्रालयों) का उपयोग कर विकसित किया गया है FUS उत्तेजना के बाद HiPSC न्यूरॉन्स की विद्युत प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए, के रूप में चित्रा 1में दिखाया गया है. यह प्रणाली अल्ट्रासाउंड मापदंडों (जैसे, आवृत्ति, फट लंबाई, तीव्रता) को बदलते समय न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं की निगरानी करने के लिए समुदाय में शोधकर्ताओं को सशक्त बनाती है। इसके अतिरिक्त, इस प्रणाली शारीरिक उत्तेजनाओं (जैसे, तापमान, दबाव, और गुहिकायन)8,9, के लिए न्यूरोनल संवेदनशीलता के नियंत्रण के एक उच्च स्तर को सक्षम बनाता है, के रूप में न्यूरॉन्स आयन चैनल कार्यक्षमता आनुवंशिक और औषधीय (जैसे, गैडोलीनियम का उपयोग आयन चैनलों को बाधित करने के लिए)10,11,12 हेरफेर किया जा सकता है. यह आणविक-स्तर नियंत्रण FUS के न्यूरोमॉड्यूलेटरी प्रभावों के पीछे के तंत्र को स्पष्ट करने में मदद कर सकता है।
यह पांडुलिपि एक उपन्यास विधि का वर्णन करती है जिसका उपयोग एफयूएस न्यूरोमॉड्यूलेशन के दौरान हिपीएससी में न्यूरोनल गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल विभिन्न FUS ट्रांसड्यूसर और MEA सिस्टम के लिए सामान्य है। वर्णित प्रोटोकॉल के साथ देखे गए परिणामों को दोहराने के लिए, शोधकर्ता को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि ट्रांसड्यूसर का केंद्र बिंदु विदेश मंत्रालय के नीचे के क्षेत्र से अधिक है। इसके अलावा, यदि विभिन्न न्यूरोनल सेल लाइनों का उपयोग किया जाता है, तो फिल्टर मापदंडों को अच्छी तरह से कोशिकाओं के लिए अपेक्षित आवृत्ति प्रतिक्रिया के लिए ट्यून किया जाना चाहिए। यदि प्रतिनिधि परिणाम प्राप्त नहीं किए जा सकते हैं, तो किसी को उपरोक्त मापदंडों (जैसे, फट लंबाई, तीव्रता, कर्तव्य चक्र, आदि) को संशोधित करने पर विचार करना चाहिए।
हालांकि इस काम ने एफयूएस उत्तेजना के बाद फायरिंग दर में वृद्धि का प्रदर्शन किया, लेकिन किसी भी निष्कर्ष को निकालने से पहले इस खोज की पुनरावृत्ति को प्रदर्शित करने के लिए अधिक डेटा एकत्र किया जाना चाहिए। यह प्रोटोकॉल विदेश मंत्रालय प्रणालियों की सीमाओं को विरासत में मिला है, जिसमें आमतौर पर प्रत्यक्ष माइक्रोइलेक्ट्रोड वर्तमान सिग्नल रिकॉर्डिंग से उत्पन्न कमजोरियां होती हैं। हालांकि न्यूरॉन के साथ सीधा संपर्क बेहतर संवेदनशीलता प्रदान करता है, यह सेल को बदल सकता है और माप सटीकता को प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, कुओं के छोटे आकार के कारण, हमारी प्रणाली में परिधीय ऊतक शामिल नहीं है, जो न्यूरोमॉड्यूलेशन17में भी भूमिका निभा सकता है। यह इस सेटअप से निकाले गए निष्कर्षों की प्रयोज्यता को विवो वातावरण में सीमित कर सकता है। अधिक जटिल नेटवर्क प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए, एक उच्च चैनल घनत्व विदेश मंत्रालय प्रणाली अपनी संवेदनशीलता18 में सुधार करने के लिए डिजाइन किया जाना चाहिए. इस प्रस्तावित प्रणाली के लिए कई भविष्य दिशाओं की पहचान की गई है, जिसमें ट्रांसड्यूसर को पकड़ने और सटीक प्लेसमेंट19 सुनिश्चित करने के लिए 3 डी गैन्ट्री का उपयोग करना शामिल है। पोस्ट-प्रोसेसिंग एल्गोरिथ्म के संबंध में अतिरिक्त सुधार किए जा सकते हैं, जिसमें व्यक्तिगत न्यूरॉन्स को वर्गीकृत करने के लिए स्पाइकिंग सॉर्टिंग एल्गोरिदम20 का उपयोग करना शामिल है। यह प्रक्रिया FUS के तंत्र पर भविष्य के अध्ययनों में बहु-इकाई न्यूरॉन्स की प्रतिक्रियाओं को अलग करने के लिए फायदेमंद होगी। सबसे महत्वपूर्ण बात, अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट करने के लिए रासायनिक, विद्युत और ऑप्टिकल उत्तेजनाओं जैसे उत्तेजना के अतिरिक्त तौर-तरीकों को शामिल करना आवश्यक है। इन तरीकों न्यूरोनल गुणों और व्यवहार बदल सकते हैं, इस तरह के विशिष्ट आयन चैनलों15 को बाधित या झिल्ली विशेषताओं21 को संशोधित करके जैसे. परिकल्पित सिग्नलिंग मार्ग के भीतर मुख्य कारकों को संशोधित करके, शोधकर्ता नियंत्रित वातावरण में प्रत्येक कारक के योगदान की पहचान कर सकते हैं और अंततः, खेल में जटिल बातचीत पर प्रकाश डाल सकते हैं।
विद्युत उत्तेजना22 न्यूरोमॉड्यूलेशन के लिए सबसे स्थापित तकनीकों में से एक है, जिसमें नैदानिक और अनुसंधान सेटिंग्स में सफल अनुप्रयोगों का एक लंबा इतिहास है। इसके विपरीत, FUS और ऑप्टोजेनेटिक्स23 अपेक्षाकृत नए तौर-तरीके हैं जिन्होंने हाल के वर्षों में ध्यान आकर्षित किया है। FUS के प्रमुख लाभ इसकी गैर-इनवेसिवनेस और गहराई पर न्यूरॉन्स को उत्तेजित करने की क्षमता है जो विद्युत उत्तेजना और ऑप्टोजेनेटिक्स सहित अन्य तकनीकों तक पहुंचना मुश्किल हो सकता है। हालांकि, ऑप्टोजेनेटिक्स24 की तरह, एफयूएस में तरंग प्रसार और संबंधित न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं के मॉडलिंग से संबंधित कुछ सीमाएं हैं। विवो में ऊतक के विषम ध्वनिक गुणों की जटिलता को पकड़ना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, जो दबाव क्षेत्र में अनिश्चितताओं की ओर जाता है और, परिणामस्वरूप, न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं में। इन गुणों को सटीक रूप से मॉडलिंग करने में यह कठिनाई विशिष्ट वास्तविक दुनिया के अनुप्रयोगों के लिए तकनीक का अनुकूलन करते समय एक चुनौती प्रस्तुत करती है। अंतर्निहित जटिलताएं इस अध्ययन में एक की तरह इन विट्रो सिस्टम के महत्व पर जोर देती हैं, क्योंकि वे नियंत्रित ध्वनिक तीव्रता स्थितियों के तहत प्रतिक्रियाओं के प्रत्यक्ष अध्ययन को सक्षम करते हैं।
अंत में, यह प्रणाली मानव न्यूरॉन्स पर FUS के न्यूरो-मॉड्यूलेटरी प्रभावों का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो प्लेटफॉर्म में एक उच्च-थ्रूपुट प्रदान करती है। इस प्रणाली के साथ, एफयूएस की कार्रवाई के तंत्र को मानव न्यूरॉन्स से विद्युत प्रतिक्रियाओं को मापकर पता लगाया जा सकता है जब एक नियंत्रित वातावरण में विभिन्न स्तरों और उत्तेजना के प्रकारों के संपर्क में आता है। इसलिए, यह आमतौर पर क्षेत्र में उपयोग किए जाने वाले मानव और पशु मॉडल के लिए एक मूल्यवान पूरक उपकरण प्रदान करता है।
The authors have nothing to disclose.
अमीर मनबाची और नीतीश ठाकोर ने डिफेंस एडवांस्ड रिसर्च प्रोजेक्ट्स एजेंसी, डीएआरपीए, अवार्ड कॉन्ट्रैक्ट: N660012024075 से फंडिंग सपोर्ट स्वीकार किया। इसके अलावा, आमिर मनबाची जॉन्स हॉपकिन्स इंस्टीट्यूट फॉर क्लिनिकल एंड ट्रांसलेशनल रिसर्च (ICTR) के क्लिनिकल रिसर्च स्कॉलर्स प्रोग्राम (KL2) से फंडिंग सपोर्ट को स्वीकार करते हैं, जो नेशनल सेंटर फॉर एडवांसिंग ट्रांसलेशनल साइंसेज (NCATS), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (NIH) द्वारा प्रशासित है। नीतीश ठाकोर ने राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) से वित्त पोषण सहायता को स्वीकार किया: R01 HL139158-01A1 और R01 HL071568-15।
MEA System | Axion Biosystem Inc. | Maestro Edge | Sampling Rate: 11500 Hz |
MEA Plate | Axion Biosystem Inc. | CytoView MEA | Electrode and Well: 16 electrodes in 24 wells |
Well plate Interface | Amcor Inc. | Parafilm PM996; P7793 | Thickness: 127 µm |
CO2 Tank and Regulator for culture | AirGas Inc./ Harris Inc. | 9296NC | Concentration: 5% |
Culture Media | ThermoFisher Inc. | Laminin; 23017-015 | Concentration: 1 µg/mL |
HiPSC Neurons | Peprotech | CIPS and GM01582 Derived; 450-10 | Concentration: 10 ng/mL (Refer Taga et al [2021]13) |
Transducer | Sonic Concepts Inc. | CTX250; 008 | Center Frequency: 250 kHz |
Matching Network | Sonic Concepts Inc. | CTX250; NFS102v2 | Impedance: 50 Ω |
Transducer Power Output (TPO) | Sonic Concepts Inc. | Version 4.1; 020 | Frequency: From 250 kHz to 2.5 MHz |
Membrane | McMaster Inc. | Silicone Rubber; 5542N115 | Thickness: 0.0127 cm |
Coupling Gel | Parker Laboratory Inc. | Aquasonic 100; B08DDWG GXB | Viscosity: 130,000–185,000 cops |
Connection to Probe holder | McMaster Inc. | Steal Threaded Rod; 90322A661 | Length: 1–1/2" Long |
Centrifuge | ThermoFisher Inc. | Sorvall Legend X1R; 75004261 | Max acceleration: 10–25,830 x g |
Hydrophone | Sonic Concepts Inc. | Y-104; 009 | Range: 50 kHz–1.9 MHz |
Water Tank | Sonic Concepts Inc. | WT | Size: 30 cm x 30 cm x 30 cm |
Water Conditioning Unit | Sonic Concepts Inc. | WCU; SN006 | Flow Velocity: 50 mL/s maximum |
Oscilloscope | Rohde-Schwarz Inc. | RTC1002 | Sampling rate: Up to 50 MHz |
Stage | Sonic Concepts Inc. | MicroStage; 2 | Accuracy: 1 µm |
Thermochromic sheet | TIPTEMP Inc. | Liquid Crystal Sheet; TLCSEN337 | Range: 22–24 °C |
Computer | Microsoft Surface | Surface Pro | CPU i5 1035G4: 3.7 GHz |
Data Transfer Software | Mathworks Inc. | MATLAB | Version 2021b |
Processing Software | Python Software Foundation | Python | Version 3.7.10 |