Här presenterar vi ett protokoll för att använda ett system med hög genomströmning som möjliggör övervakning och kvantifiering av de neuromodulerande effekterna av fokuserat ultraljud på humant inducerade pluripotenta stamcellsneuroner (HiPSC).
De neuromodulerande effekterna av fokuserat ultraljud (FUS) har visats i djurmodeller, och FUS har använts framgångsrikt för att behandla rörelse och psykiatriska störningar hos människor. Men trots framgången med FUS är mekanismen bakom dess effekter på nervceller fortfarande dåligt förstådd, vilket gör det svårt att optimera behandlingen genom att justera FUS-parametrarna. För att ta itu med denna kunskapslucka studerade vi humana nervceller in vitro med hjälp av nervceller odlade från humaninducerade pluripotenta stamceller (HiPSCs). Genom att använda HiPSCs kan man studera människospecifika neuronala beteenden i både fysiologiska och patologiska tillstånd. Denna rapport presenterar ett protokoll för att använda ett system med hög genomströmning som möjliggör övervakning och kvantifiering av de neuromodulerande effekterna av FUS på HiPSC-neuroner. Genom att variera FUS-parametrarna och manipulera HiPSC-neuronerna genom farmaceutiska och genetiska modifieringar kan forskare utvärdera de neurala svaren och belysa de neuromodulerande effekterna av FUS på HiPSC-neuroner. Denna forskning kan få betydande konsekvenser för utvecklingen av säkra och effektiva FUS-baserade terapier för en rad neurologiska och psykiatriska störningar.
Fokuserat ultraljud (FUS) är en lovande neuromoduleringsmodalitet som möjliggör icke-invasiv stimulering på centimeternivå djup med submillimeterupplösning 1,2,3. Trots dessa styrkor är den kliniska effekten av FUS begränsad, delvis på grund av bristande kunskap om dess verkningsmekanism. Utan en solid teoretisk grund har forskare och kliniker svårt att skräddarsy behandlingen för att möta de specifika behoven hos enskilda patienter under olika förhållanden. En framträdande teori som föreslagits av Yoo et al.4 föreslår att mekanokänsliga jonkanaler är ansvariga för neuronaktivering. Denna teori misslyckas dock med att förklara FUS-aktivering i mänskliga hjärnneuroner, som saknar dessa kanaler5. Denna tvetydighet begränsar användningen av FUS i kliniken, eftersom den utesluter justering av FUS-parametrar för att optimera behandlingsresultaten.
Tidigare relaterade studier har använt en rad olika metoder för att undersöka de fysiologiska mekanismer som ligger till grund för FUS och för att bestämma de optimala stimuleringsparametrarna. Ett avgörande steg i denna process involverar övervakning av neuronala svar som återkoppling, vilket kan uppnås genom metoder som involverar jon-gate-övervakning, såsom kalciumjonavbildning4, optisk avbildning1 och ex vivo elektrofysiologisk registrering (t.ex. elektromyografi6 eller hud-nervelektrofysiologi7). De flesta av dessa studier använder dock icke-mänskliga neuroner eller in vivo-metoder, vilket kan introducera ytterligare variationer på grund av suboptimala kontroller. Att däremot använda elektroder för att mäta neuronala signaler i in vitro human-inducerade pluripotenta stamcellsneuroner (HiPSC) ger känsligare mätningar och större kontroll över den experimentella miljön. I detta arbete har ett in vitro-system utvecklats med hjälp av mikroelektrodmatriser (MEA) för att mäta de elektriska svaren hos HiPSC-neuroner efter FUS-stimulering, som visas i figur 1. Detta system gör det möjligt för forskare i samhället att övervaka neuronala svar när man varierar ultraljudsparametrarna (t.ex. frekvens, burstlängd, intensitet). Dessutom möjliggör detta system en hög nivå av kontroll av neuronal känslighet för fysiska stimuli (t.ex. temperatur, tryck och kavitation)8,9, eftersom neuronernas jonkanalfunktionalitet kan manipuleras genetiskt och farmaceutiskt (t.ex. genom att använda gadolinium för att hämma jonkanaler)10,11,12. Denna kontroll på molekylär nivå kan bidra till att belysa mekanismerna bakom de neuromodulerande effekterna av FUS.
Detta manuskript beskriver en ny metod som kan användas för att registrera neuronal aktivitet i HiPSCs under FUS neuromodulering. Detta protokoll är generaliserbart till olika FUS-givare och MEA-system. För att replikera de observerade resultaten med det beskrivna protokollet bör forskaren se till att givarens brännpunkt är större än arean på botten av MEA-brunnen. Dessutom, om olika neuronala cellinjer används, måste filterparametrarna ställas in på det förväntade frekvenssvaret för cellerna i brunnen. Om representativa resultat inte kan uppnås bör man överväga att modifiera de ovannämnda parametrarna (t.ex. spränglängd, intensitet, arbetscykel, etc.).
Även om detta arbete visade en ökning av avfyrningshastigheten efter FUS-stimulering, måste mer data samlas in för att visa repeterbarheten av detta fynd innan några slutsatser dras. Detta protokoll ärver begränsningarna hos MEA-system, som vanligtvis har svagheter som härrör från den direkta mikroelektrodströmsignalen. Även om direktkontakt med neuronen ger bättre känslighet, kan det förändra cellen och påverka mätnoggrannheten. Dessutom, på grund av brunnarnas lilla storlek, inkluderar vårt system inte perifer vävnad, vilket också kan spela en roll i neuromodulering17. Detta kan begränsa tillämpligheten av de slutsatser som dras från denna konfiguration till in vivo-miljöer . För att studera mer komplexa nätverkssvar måste ett MEA-system med högre kanaltäthet utformas för att förbättra dess känslighet18. Flera framtida riktningar för detta föreslagna system har identifierats, inklusive användning av en 3D-portal för att hålla givaren och säkerställa korrekt placering19. Ytterligare förbättringar kan göras när det gäller efterbehandlingsalgoritmen, inklusive att använda en spikande sorteringsalgoritm20 för att klassificera enskilda neuroner. Denna process skulle vara fördelaktig för att reda ut svaren från neuroner med flera enheter i framtida studier av mekanismerna för FUS. Viktigast av allt är att det är viktigt att införliva ytterligare stimuleringsmetoder, såsom kemiska, elektriska och optiska stimuli, för att belysa de underliggande mekanismerna. Dessa metoder kan förändra neuronala egenskaper och beteenden, till exempel genom att hämma specifika jonkanaler15 eller modifiera membranegenskaperna21. Genom att modulera huvudfaktorerna inom den hypotetiska signalvägen kan forskare identifiera bidragen från varje faktor i kontrollerade miljöer och i slutändan kasta ljus över de komplexa interaktioner som spelar in.
Elektrisk stimulering22 är en av de mest etablerade teknikerna för neuromodulering, med en lång historia av framgångsrika tillämpningar i kliniska och forskningsmiljöer. FUS och optogenetik23 är däremot relativt nya modaliteter som har fått uppmärksamhet de senaste åren. De stora fördelarna med FUS är dess icke-invasivitet och förmåga att stimulera nervceller på djup som kan vara svåra att nå med andra tekniker, inklusive elektrisk stimulering och optogenetik. Liksom optogenetik24 har FUS dock vissa begränsningar relaterade till modellering av vågutbredningen och associerade neuronala svar. Att fånga komplexiteten i vävnadens heterogena akustiska egenskaper in vivo kan vara utmanande, vilket leder till osäkerheter i tryckfältet och därmed i de neuronala svaren. Denna svårighet att exakt modellera dessa egenskaper utgör en utmaning när man optimerar tekniken för specifika verkliga applikationer. Den inneboende komplexiteten understryker vikten av in vitro-system som det i denna studie, eftersom de möjliggör direkta studier av respons under kontrollerade akustiska intensitetsförhållanden.
Sammanfattningsvis ger detta system en högkapacitets, in vitro-plattform för att studera de neuromodulerande effekterna av FUS på humana neuroner. Med detta system kan verkningsmekanismerna för FUS undersökas genom att mäta de elektriska svaren från mänskliga nervceller när de utsätts för olika nivåer och typer av stimulering i en kontrollerad miljö. Därför erbjuder den ett värdefullt kompletterande verktyg till de människo- och djurmodeller som vanligtvis används inom området.
The authors have nothing to disclose.
Amir Manbachi och Nitish Thakor bekräftar finansieringsstöd från Defense Advanced Research Projects Agency, DARPA, Award Contract: N660012024075. Dessutom erkänner Amir Manbachi finansieringsstöd från Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research (ICTR)’s Clinical Research Scholars Program (KL2), som administreras av National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS), National Institutes of Health (NIH). Nitish Thakor bekräftar finansieringsstöd från National Institutes of Health (NIH): R01 HL139158-01A1 och R01 HL071568-15.
MEA System | Axion Biosystem Inc. | Maestro Edge | Sampling Rate: 11500 Hz |
MEA Plate | Axion Biosystem Inc. | CytoView MEA | Electrode and Well: 16 electrodes in 24 wells |
Well plate Interface | Amcor Inc. | Parafilm PM996; P7793 | Thickness: 127 µm |
CO2 Tank and Regulator for culture | AirGas Inc./ Harris Inc. | 9296NC | Concentration: 5% |
Culture Media | ThermoFisher Inc. | Laminin; 23017-015 | Concentration: 1 µg/mL |
HiPSC Neurons | Peprotech | CIPS and GM01582 Derived; 450-10 | Concentration: 10 ng/mL (Refer Taga et al [2021]13) |
Transducer | Sonic Concepts Inc. | CTX250; 008 | Center Frequency: 250 kHz |
Matching Network | Sonic Concepts Inc. | CTX250; NFS102v2 | Impedance: 50 Ω |
Transducer Power Output (TPO) | Sonic Concepts Inc. | Version 4.1; 020 | Frequency: From 250 kHz to 2.5 MHz |
Membrane | McMaster Inc. | Silicone Rubber; 5542N115 | Thickness: 0.0127 cm |
Coupling Gel | Parker Laboratory Inc. | Aquasonic 100; B08DDWG GXB | Viscosity: 130,000–185,000 cops |
Connection to Probe holder | McMaster Inc. | Steal Threaded Rod; 90322A661 | Length: 1–1/2" Long |
Centrifuge | ThermoFisher Inc. | Sorvall Legend X1R; 75004261 | Max acceleration: 10–25,830 x g |
Hydrophone | Sonic Concepts Inc. | Y-104; 009 | Range: 50 kHz–1.9 MHz |
Water Tank | Sonic Concepts Inc. | WT | Size: 30 cm x 30 cm x 30 cm |
Water Conditioning Unit | Sonic Concepts Inc. | WCU; SN006 | Flow Velocity: 50 mL/s maximum |
Oscilloscope | Rohde-Schwarz Inc. | RTC1002 | Sampling rate: Up to 50 MHz |
Stage | Sonic Concepts Inc. | MicroStage; 2 | Accuracy: 1 µm |
Thermochromic sheet | TIPTEMP Inc. | Liquid Crystal Sheet; TLCSEN337 | Range: 22–24 °C |
Computer | Microsoft Surface | Surface Pro | CPU i5 1035G4: 3.7 GHz |
Data Transfer Software | Mathworks Inc. | MATLAB | Version 2021b |
Processing Software | Python Software Foundation | Python | Version 3.7.10 |