यह पेपर फ्लो साइटोमेट्री और इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सामान्य मानव और माउस रक्त और अस्थि मज्जा में उपकला कोशिकाओं की उपस्थिति पर नए निष्कर्षों के साथ एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि प्रस्तुत करता है। इन निष्कर्षों की पुष्टि करने के लिए Krt1-14;mTmG ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग विवो विधि के रूप में किया गया था।
कैंसर और अन्य बीमारियों के रोगियों के रक्त और अस्थि मज्जा में उपकला कोशिकाओं की पहचान की गई है। हालांकि, स्वस्थ व्यक्तियों के रक्त और अस्थि मज्जा में सामान्य उपकला कोशिकाओं की उपस्थिति को अभी तक एक सुसंगत तरीके से पहचाना नहीं गया है। यहां प्रस्तुत फ्लो साइटोमेट्री और इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके स्वस्थ मानव और मुराइन रक्त और अस्थि मज्जा (बीएम) से उपकला कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि है। स्वस्थ व्यक्तियों में उपकला कोशिकाओं को पहली बार उपकला कोशिका आसंजन अणु (ईपीकैम) का उपयोग करके फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से पहचाना और अलग किया गया था। इन ईपीकैम + कोशिकाओं को Krt1-14;mTmG ट्रांसजेनिक चूहों में इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके केराटिन व्यक्त करने की पुष्टि की गई थी। मानव रक्त के नमूनों में 0.18% ± 0.0004 ईपीकैम + कोशिकाएं थीं (एसईएम; एन = 7 जैविक प्रतिकृतियां, 4 प्रयोगात्मक प्रतिकृतियां)। मानव बीएम में, मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं ± 3.53% 0.006 (एसईएम; एन = 3 जैविक प्रतिकृतियां, 4 प्रयोगात्मक प्रतिकृतियां) ईपीकैम + थे। माउस रक्त में, ईपीकैम + कोशिकाओं ने 0.45% ± 0.0006 (एसईएम; एन = 2 जैविक प्रतिकृतियां, 4 प्रयोगात्मक प्रतिकृतियां) का गठन किया, और माउस बीएम में, 5.17% ± 0.001 (एसईएम; एन = 3 जैविक प्रतिकृतियां, 4 प्रयोगात्मक प्रतिकृतियां) ईपीकैम + थे। चूहों में, सभी ईपीकैम + कोशिकाएं पैन-साइटोकेराटिन के लिए इम्यूनोरिएक्टिव थीं, जैसा कि आईएफ माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित किया गया था। Krt1-14;mTmG ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करके परिणामों की पुष्टि की गई, जिसमें कम (8.6 देशी जीएफपी + कोशिकाएं प्रति 106 कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया; व्यवहार्य कोशिकाओं का 0.085%), लेकिन सामान्य मुराइन बीएम में मौजूद जीएफपी + कोशिकाओं की महत्वपूर्ण संख्या (पी < 0.0005) थी, जो कई नकारात्मक नियंत्रणों की तुलना में यादृच्छिकता का परिणाम नहीं थे। इसके अलावा, माउस रक्त में ईपीकैम + कोशिकाएं सीडी 45 + कोशिकाओं (बीएम में 0.58%, रक्त में 0.13%) की तुलना में अधिक विषम थीं। इन अवलोकनों से निष्कर्ष निकलता है कि साइटोकेराटिन प्रोटीन को व्यक्त करने वाली कोशिकाएं मानव और मुराइन रक्त और बीएम से मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के बीच पुन: पता लगाने योग्य हैं। हम ऊतक संचयन, फ्लो साइटोमेट्री और इम्यूनोस्टेनिंग की एक विधि का प्रदर्शन करते हैं जिसका उपयोग स्वस्थ व्यक्तियों में इन पैन-साइटोकेराटिन उपकला कोशिकाओं के कार्य को पहचानने और निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है।
उपकला कोशिकाएं हमारे शरीर और पर्यावरण के बीच भौतिक बाधाओं में पाई जाती हैं और उनके माइक्रोएन्वायरमेंट1 में परिवर्तन को पहचानने और प्रतिक्रिया देने में सक्षम होती हैं। उनके पास एक प्रसार स्टेम सेल आला है जो नए ऊतक को बदलने और क्षति की मरम्मत करने का एक तरीका प्रदान करताहै2. हमारी प्रयोगशाला त्वचा के बालों के रोम में स्टेम कोशिकाओं का अध्ययन करती है; त्वचा उपकला ऊतक और स्टेम सेल प्रसार का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा मॉडल है क्योंकि यह आसानी से दिखाई देता है और कोशिकाओं का निरंतर कारोबार होता है। उपकला कैंसर कैंसर का सबसे आम रूप है, संभवतः उपकला ऊतकों के कारण, जैसे कि त्वचा, पर्यावरणीय कार्सिनोजेन्स के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति है, जिससे उच्च टर्नओवर दर और उपकला कोशिकाओं का प्रसारहोता है। अधिकांश त्वचा एपिडर्मिस, शीर्ष सुरक्षात्मक परत, केराटिनोसाइट्स से बना होता है, जो समर्थन और संरचनाप्रदान करने के लिए विभिन्न प्रकार के केराटिन व्यक्त करता है। उपकला कैंसर वाले रोगियों में अक्सर उनके रक्त और अस्थि मज्जा में मौजूद उपकला कोशिकाएं होती हैं जो केराटिन को भी व्यक्त करती हैं। तरल बायोप्सी विभिन्न शारीरिक तरल पदार्थों में इन उपकला कोशिकाओं का पता लगाने और निगरानीकरने का एक गैर-आक्रामक तरीका है। परिसंचारी उपकला कोशिकाएं, जिन्हें परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाएं (सीटीसी) भी कहा जाता है, परिधीय रक्त में पाई जाती हैं और कैंसर के पूर्वानुमान के लिए बायोमार्कर हो सकती हैं, साथ ही व्यक्तिगत चिकित्सा उपचार का मार्गदर्शन भी कर सकती हैं। सीटीसी रोग की प्रगति, उपचार प्रभावकारिता और समग्र रोगी अस्तित्व 5,6 का संकेत भी दे सकता है।
एपिथेलियल सेल आसंजन अणु (ईपीकैम) सीटीसी के लिए एक चिकित्सकीय रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला मार्कर है और कैंसर रोगियों में उपकला मूल के ट्यूमर की पहचान कर सकता है। ईपीकैम सेल आसंजन, प्रवासन, सिग्नलिंग, प्रसार और भेदभाव6 में एक भूमिका निभाता है। एक परिसंचारी उपकला कोशिका को सीटीसी के रूप में वर्गीकृत करने के लिए, यह साइटोकेराटिन 8, 18 और 19 के लिए सकारात्मक होना चाहिए, और सीडी 45 के लिए नकारात्मक होना चाहिए, एक सामान्य ल्यूकोसाइट मार्कर6। सीटीसी को आमतौर पर चुंबकीय माइक्रोबीड्स के साथ सीडी 45 को कम करके पहचाना जाता है, इसके बाद इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी7 का उपयोग करके ईपीसीएएम और साइटोकेराटिन 19 के लिए परीक्षण किया जाता है। सीटीसी का पता लगाने में मुख्य सीमा उनकी दुर्लभता है; वे रक्त में सभी कोशिकाओं के 0.01% से कम बनाते हैं, और बहुत कम दूर के अंगों 8,9,10 तक पहुंचने के लिए परिसंचरण में जीवित रहते हैं। इन कोशिकाओं को उनकी दुर्लभ प्रकृति के कारण अलग करने और पहचानने के लिए प्रयोगों और तकनीकों को डिजाइन करने में विचार किया जाना चाहिए। वर्तमान में, सीटीसी की पहचान के लिए उपयोग किए जाने वाले केवल एक खाद्य और औषधि प्रशासन (एफडीए) द्वारा अनुमोदित स्वचालित एकल-सेल सॉर्टर है, और यह अपने बायोमार्कर के रूप में ईपीकैम का उपयोग करता है। अन्य तरीकों में चुंबकीय मोती पृथक्करण और प्रवाह साइटोमेट्री, या इन विधियों का एक संयोजन शामिल है। दुर्लभ सीटीसी11 का पता लगाने के लिए नई तकनीकों की आवश्यकता है जिनमें उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता है।
फ्लो साइटोमेट्री रक्त, अस्थि मज्जा और अन्य ऊतक नमूनों में दुर्लभ कोशिका आबादी का पता लगाने के लिए एक पसंदीदा तरीका है। इन दुर्लभ कोशिकाओं में स्टेम सेल, परिसंचारी एंडोथेलियल कोशिकाएं, सीटीसी और अवशिष्ट रोग कोशिकाएं शामिल हो सकती हैं। फ्लो साइटोमेट्री प्रत्येक सेल प्रकार के मात्रात्मक माप को सक्षम करता है और इन कोशिकाओं को आगे के परीक्षणके लिए 7,9 को क्रमबद्ध करता है। इन दुर्लभ कोशिकाओं का सटीक मूल्यांकन सुनिश्चित करने के लिए वृद्धिशील गणना की गई। आगे के विश्लेषण से कोशिकाओं को बाहर करने के लिए गेटिंग का उपयोग करने की क्षमता कोशिकाओं का विश्लेषण करते समय विशिष्टता बढ़ाने का एक तरीका है। फ्लो साइटोमेट्री की सीमाएं बड़े नमूनों के विश्लेषण के लिए आवश्यक समय और सेल पहचान के लिए दृश्य पुष्टि की कमी है। इसे दूर करने के लिए, उनकी पहचान की पुष्टि करने के लिए क्रमबद्ध कोशिकाओं पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी की गई थी।
इससे पहले हमारी प्रयोगशाला ने दिखाया है कि चूहों में अस्थि मज्जा कोशिकाओं की भर्ती की जाती है और त्वचा ट्यूमर12 में योगदान करती है। ये अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न कोशिकाएं पैन-साइटोकेराटिन और एपिडर्मल साइटोकेराटिन के लिए सकारात्मक हैं। ट्यूमर की प्रगति में उपकला स्टेम कोशिकाओं, अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न कोशिकाओं और साइटोकेराटिन-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की भूमिका को और स्पष्ट करने के लिए, सामान्य मुराइन और मानव रक्त और अस्थि मज्जा के नमूनों में ईपीकैम + साइटोकेराटिन-पॉजिटिव कोशिकाओं की तलाश की गई। अधिकांश प्रयोगों के साथ, इस विधि को कई पुनरावृत्तियों के माध्यम से विकसित किया गया था। इससे पहले, ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग अस्थि मज्जा12 में के 14जीएफपी-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की तलाश के लिए वृद्धिशील गणना के साथ किया गया था। जैसा कि अधिक कोशिकाओं की गणना की गई थी, दुर्लभ कोशिकाओं की एक प्रतिनिधि आबादी की पहचान की जा सकती थी, जैसा कि प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में चित्रा 1 में दिखाया गया है। सामान्य रक्त और अस्थि मज्जा में उपकला कोशिकाओं की जांच करने का तर्क सीटीसी पर प्रारंभिक साहित्य पर आधारित था, जहां सामान्य स्वस्थ दाताओं में ईपीकैम + कोशिकाओं13 के पृष्ठभूमि स्तर थे। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, ईपीकैम लक्षण वर्णन अक्सर सीडी 45 की कमी के साथ शुरू होता है। इस कदम को छोड़ दिया गया था क्योंकि कुछ हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं में अज्ञात कारणों से ईपीकैम और साइटोकेराटिन अभिव्यक्ति होती है जिन्हें आगे की जांच करने की आवश्यकता होती है। इसलिए, कोशिकाओं को कोशिका वंश के बावजूद ईपीसीएएम की उपस्थिति या अनुपस्थिति के आधार पर क्रमबद्ध किया गया था, और फिर साइटोकेराटिन के लिए इम्यूनोस्टेन्ड किया गया था। नीचे दिए गए प्रोटोकॉल और चित्रा 2 में दिखाए गए वर्कफ़्लो एक ऐसी तकनीक का वर्णन करते हैं जो उपकला कोशिकाओं की इन दुर्लभ आबादी को अलग करने और पहचानने के लिए मुआवजे और नियंत्रण, सांख्यिकीय विधियों और इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग के साथ फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करता है।
अस्थि मज्जा में उपकला कोशिकाओं की उपस्थिति के साहित्य में कुछ सबूत हैं। पहले, कागजात ने आमतौर पर बीमारी और चोट के संदर्भ में उपकला कोशिकाओं की भूमिका की जांच की है, जैसे कि यकृत, फेफड़े, गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) पथ, थाइमस और त्वचा14,15,16,17। हालांकि, स्वस्थ व्यक्तियों के अस्थि मज्जा में इन उपकला कोशिकाओं की उपस्थिति के बारे में बहुत कुछ ज्ञात नहीं है। यह पेपर सामान्य रक्त और अस्थि मज्जा से उपकला कोशिकाओं की पहचान और पृथक्करण के उद्देश्य से एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि स्थापित करना चाहता है। यह विधि क्षेत्र को यह पहचानने के लिए आगे बढ़ाएगी कि उपकला कोशिकाएं क्यों मौजूद हैं और बीमारी की अनुपस्थिति में रक्त और अस्थि मज्जा में उनकी भूमिका क्या है; शायद ये कोशिकाएं सामान्य ऊतक रखरखाव का हिस्सा हैं या चोट के समय सक्रिय हैं। अस्थि मज्जा स्टेम कोशिकाओं का भंडार है; हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि इन उपकला कोशिकाओं का वंश क्या हो सकता है। हाल ही के एक पेपर में थाइमस में अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न उपकला कोशिकाओं पर चर्चा की गई है, जो पहले ईपीसीएएम और हेमटोपोइएटिक मार्कर सीडी 45 को व्यक्त करता है, और फिर चोट 15 के बाद समय के साथ अपनी सीडी45 अभिव्यक्ति खो देता है। हमारी प्रयोगशाला के शोध ने चोट12 की अनुपस्थिति में स्वस्थ रक्त और अस्थि मज्जा के भीतर सीडी 45 + ईपीकैम + कोशिकाओं की उपस्थिति की भी पुष्टि की है। हालांकि, इन कोशिकाओं की भूमिका अभी तक निर्धारित नहीं की गई है।
स्वस्थ अस्थि मज्जा के भीतर उपकला कोशिकाओं की जांच के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि की आवश्यकता थी। वर्णित विधि इन कोशिकाओं को उनकी सामान्य स्थिति में और अधिक चिह्नित करने में मदद करेगी। प्रजनन क्षमता बनाए रखने के लिए इस विधि में महत्वपूर्ण कदम हैं। इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदमों में से एक चूहों से अस्थि मज्जा की कटाई करते समय हुड में एक बाँझ वातावरण बनाए रखना है। यदि कई चूहों से कटाई की जाती है, तो प्रत्येक माउस के लिए नई सुइयों और सिरिंज का उपयोग करके नमूनों के बीच क्रॉस-संदूषण से बचा जाता है। यह भी सुनिश्चित करता है कि नमूना साफ है और किसी भी दूषित पदार्थों से मुक्त है जो परिणामों को प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, प्रत्येक अतिरिक्त माउस के लिए तैयार सिरिंज और लेबल शंक्वाकार ट्यूबों की संख्या में वृद्धि की जानी चाहिए। एक अन्य महत्वपूर्ण कदम में हड्डियों को फ्लश करना शामिल है जब तक कि एक साफ सफेद रंग स्पष्ट न हो ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि अधिकांश अस्थि मज्जा कोशिकाओं को हटा दिया गया है; एक शुद्ध नमूने में दुर्लभ कोशिकाओं का पता लगाने की संभावना बढ़ जाती है। लाल रक्त कोशिका लाइसिस प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए एक संशोधन किया गया था; कई लाइसिस बफर का परीक्षण सही एक को खोजने के लिए किया गया था जो लगातार उच्च व्यवहार्यता देता था, क्योंकि इस चरण के दौरान लगभग आधी कोशिकाएं खो रही थीं। अन्य सेटिंग्स में बेहतर परिणामों के लिए विभिन्न अभिकर्मकों और इनक्यूबेशन अवधियों को अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।
इस प्रोटोकॉल की सबसे महत्वपूर्ण सीमा दुर्लभ सेल आबादी खोजने के लिए फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग कर रही है। जैसा कि पहले चर्चा की गई है, नियंत्रण और वृद्धिशील गणना के अतिरिक्त विश्लेषण की विशिष्टता और सटीकता को बढ़ाने में मदद करता है। एक और सीमा यह है कि रुचि की आबादी के लिए उपयुक्त मार्करों को पहले से पहचाना जाना चाहिए। इस प्रकार, किसी को प्रमुख मार्करों, फ्लो साइटोमेट्री के लिए एंटीबॉडी और लक्षित प्रजातियों के साथ संगत एंटीबॉडी के बारे में जानने की आवश्यकता है।
ये विधियां मौजूदा तरीकों पर एक सुधार हैं क्योंकि वे मौजूदा स्वचालित सीटीसी आइसोलेटर और एकल सेल आरएनए अनुक्रमण की लागत के एक अंश पर एकल सेल विश्लेषण की अनुमति देते हैं। इसके अतिरिक्त, फ्लो साइटोमेट्री अधिक आसानी से उपलब्ध है। एफएसीएस ने चुंबकीय माइक्रोबीड पृथक्करण का उपयोग करके पूर्व रिपोर्ट किए गए परिणामों की तुलना में कोशिकाओं के लिए उच्च व्यवहार्यता बनाए रखी। अंत में, ये तकनीकें डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए कोशिकाओं को अलग करने की अनुमति देती हैं, जैसे कि थोक आरएनए अनुक्रमण, एससीआरएनए अनुक्रमण, या सेल कल्चर।
The authors have nothing to disclose.
जोश मॉन्ट्स, कोर सुविधा फ्लो साइटोमीटर तकनीशियन, द होर्मेल इंस्टीट्यूट
टॉड शूस्टर, कोर सुविधा प्रबंधक, द होर्मेल इंस्टीट्यूट
डेरेक गॉर्डन, सांख्यिकीविद्, रटगर्स विश्वविद्यालय
हम अपनी संपादकीय सहायता के लिए क्लेरस संपादकीय सेवाओं, सांता फे, एनएम से करेन क्लेन को धन्यवाद देना चाहते हैं।
इस काम को पुरस्कार संख्या आर 21 एआर 075281 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के गठिया और मस्कुलोस्केलेटल और त्वचा रोग के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था, और अनुसंधान, कलात्मकता और छात्रवृत्ति का अनुदान, अनुसंधान के लिए उपाध्यक्ष का कार्यालय, मिनेसोटा विश्वविद्यालय (प्रस्ताव # 324240)। हम होर्मेल संस्थान से कृतज्ञतापूर्वक समर्थन स्वीकार करते हैं।
40 μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Used to filter out any large clumps of cells from bone marrow |
5 mL Polystyrene Round-bottom tube | Falcon | 352054 | Tubes used for flow cytometry |
500 mL jar with lid | Nalgene | 11-823-32 | Used to wash the mouse |
190 proof Ethanol | Decon laboratories Inc | 2801 | Diluted to 70% with dH2O |
Alexa Fluor 488 Goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | Dilution: 1:1000 |
Brightline Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-10 | Used to count alive cells |
Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | Component of antibody diluent |
Characterized Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | Component of staining buffer and harvesting solution |
Curity gauze sponges | Covidien | 2187 | Used to keep a clean work area when harvesting limbs and bone marrow |
Curved Forceps | Miltex | 18-784 | Used during harvest |
Cytokeratin, Wide Spectrum Screening | Dako | Z0622 | Dilution 1:750 *Now discontinued |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS 1x) | Gibco | 14190-144 500mL | Used to stop the red blood cell lysis reaction |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E9884-100G | Used at 0.5 M |
Gentamicin sulfate | Lonza | 17-518Z | Component of harvesting solution |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS 1x) | Gibco | 14175-095 500mL | Component of harvesting solution and staining buffer solution |
Luer-Lok tip 10 mL syringe | Becton, Dickinson and Co | 309604 | Used with 26G needle to flush bones, used with 20G needle to break up clumps |
Magic touch 2 ice bucket | BelArt | M16807-2001 | Used to store the specimens on ice |
Nonfat dry milk | Apex | 20-241 | Component of Antibody Diluent |
Normal horse serum | Vector | ZE0122 | Component of Antibody Diluent |
PE anti-human CD 326 (EpCAM) | Biolegend | 324206 | Dilution: 5 µl in 100 µl per 1×106 cells |
PE anti-mouse CD 326 (EpCAM) | Biolegend | 118205 | Dilution: 3 µl in 100 µl per 1×106 cells |
PE mouse IgG2b, κ isotype control | Biolegend | 400313 | Dilution: 1 µl in 100 µl per 1×106 cells |
PE rat anti-human CD49f | BD Biosciences | 555763 | Dilution: 20 µl in 100 µl per 1×106 cells |
PE rat IgG2am, κ Isotype control | Biolegend | 400508 | Dilution: 1 µl in 100 µl per 1×106 cells |
Polypropylene Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Basix | 14-955-240 | Used in the centrifuge |
Povidone-Iodine Scrub | Aplicare | 82-227 | Antiseptic used to sterilize the mice |
PrecisionGlide Needle 20G x 1 1/2 | Becton, Dickinson and Co | 305176 | 20G needle used to break up bone marrow clumps |
PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 | Becton, Dickinson and Co | 305111 | 26G needle used to flush bone marrow from bones |
PTFE Printed Slides | Electron Microscopy Services | 63422-06 | 8 well slides cells sorted onto for immunofluorescence |
RBC Lysis buffer 10X | Invitrogen | 00-4300-54 | Dilution 1:10 using sterile deionized water |
Scissors | Roboz | RS-6762 | Used during harvest |
Stainless steel surgical blade #4 | Bard-Parker | 371222 | Used during harvest |
Sterile tray | Polar ware | 10F | Used during harvest |
StretchEase Powder-free nitrile examination gloves | Denville Scientific | G4161 | Used during harvest |
Surgical Scalpel handle #4 | Fischer | 12-000-164 | Used with surgical blade |
TBS 20x | Thermo | Component of TBST, used at 1X | |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | Used to count dead cells. Filtered with .45 µm |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379-500mL | Component of TBST |
Tweezers | Miltex | 6-8 | Used during harvest |
Vectashield Vibrance Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1800 | Nuclear stain for immunofluorescence |