Bioortogonal kemisk avbildning av cellmetabolism reglerad av aromatiska aminosyror
Summary
Vi presenterar ett protokoll för att direkt visualisera metaboliska aktiviteter i celler som regleras av aminosyror med hjälp av deuteriumoxid (tungt vatten D2O) sonderad stimulerad Raman-spridning (DO-SRS) mikroskopi, som är integrerad med två-fotonexcitationsfluorescensmikroskopi (2PEF).
Abstract
Essentiella aromatiska aminosyror (AAA) är byggstenar för att syntetisera ny biomassa i celler och upprätthålla normala biologiska funktioner. Till exempel är ett rikligt utbud av AAA viktigt för cancerceller att behålla sin snabba tillväxt och delning. Med detta finns det en ökande efterfrågan på en mycket specifik, icke-invasiv bildmetod med minimal provberedning för att direkt visualisera hur celler utnyttjar AAA för sin metabolism in situ. Här utvecklar vi en optisk avbildningsplattform som kombinerar deuteriumoxid (D2O) sondering med stimulerad Raman-spridning (DO-SRS) och integrerar DO-SRS med tvåfotonexcitationsfluorescens (2PEF) i ett enda mikroskop för att direkt visualisera de metaboliska aktiviteterna hos HeLa-celler under AAA-reglering. Sammantaget ger DO-SRS-plattformen hög rumslig upplösning och specificitet av nyligen syntetiserade proteiner och lipider i enskilda HeLa-cellenheter. Dessutom kan 2PEF-modaliteten detektera autofluorescenssignaler av nikotinamidadenindinukleotid (NADH) och Flavin på ett etikettfritt sätt. Bildsystemet som beskrivs här är kompatibelt med både in vitro- och in vivo-modeller , vilket är flexibelt för olika experiment. Det allmänna arbetsflödet för detta protokoll inkluderar cellodling, förberedelse av odlingsmedia, cellsynkronisering, cellfixering och provavbildning med DO-SRS- och 2PEF-modaliteter.
Introduction
Att vara essentiella aromatiska aminosyror (AAA), fenylalanin (Phe) och tryptofan (Tryp) kan absorberas av människokroppen för att syntetisera nya molekyler för att upprätthålla normala biologiska funktioner1. Phe behövs för syntesen av proteiner, melanin och tyrosin, medan Tryp krävs för syntesen av melatonin, serotonin och niacin 2,3. Överdriven konsumtion av dessa AAA kan dock uppreglera däggdjursmålet för rapamycinvägen (mTOR), hämma AMP-aktiverat proteinkinas och störa mitokondriell metabolism, kollektivt förändra makromolekylbiosyntesen och leda till produktion av maligna prekursorer, såsom reaktiva syreradikaler (ROS) i friska celler 4,5,6. Direkt visualisering av förändrad metabolisk dynamik under överskott av AAA-reglering är avgörande för att förstå AAA: s roller för att främja cancerutveckling och tillväxt av friska celler 7,8,9.
Traditionella AAA-studier bygger på gaskromatografi (GC)10. Andra metoder, såsom magnetisk resonanstomografi (MRT), har begränsade rumsliga upplösningar, vilket gör det svårt att utföra cellulär och subcellulär analys av biologiska prover11. Nyligen har matrisassisterad laserdesorption / jonisering (MALDI) utvecklats för att belysa AAA: s roll i lipid- och proteinsynteser vid cancerproliferation med icke-invasiva biomarkörer12,13,14. Denna teknik lider dock fortfarande av grunda bilddjup, dålig rumslig upplösning och omfattande provberedning. På cellulär nivå kan icke-toxiska stabila isotoper, såsom kväve-15 och kol-13, spåras med multiisotopavbildning och nanoskala sekundär jonmasspektrometri för att förstå deras införlivande i makromolekyler. Dessa metoder är dock destruktiva för levande biologiska prover15,16. Atomkraftmikroskopi (AFM) är en annan kraftfull teknik som kan visualisera metabolisk dynamik17. Den långsamma skanningshastigheten under AFM-avbildning kan å andra sidan orsaka bildförvrängning av resultatet från termisk drift.
Vi utvecklade en icke-invasiv biortogonal avbildningsmodalitet genom att koppla deuteriumoxid (D2O) sonderad stimulerad Raman-spridning (DO-SRS) mikroskopi och etikettfri tvåfotonexcitationsfluorescensmikroskopi (2PEF). Denna modalitet uppnår en hög rumslig upplösning och kemisk specificitet vid avbildning av biologiska prover 18,19,20,21,22,23,24. Detta protokoll introducerar tillämpningar av DO-SRS och 2PEF för att undersöka den metaboliska dynamiken hos lipider, protein och redoxkvotförändringar under cancerprogressioner. EftersomD2Oär en stabil isotopform av vatten kan cellulära biomolekyler märkas med deuterium (D) på grund av dess snabba kompensation med totalt kroppsvatten i celler och bildar kol-deuterium (C-D) bindningar genom enzymatisk utbyte21. C-D-bindningarna i nyligen syntetiserade makromolekyler, inklusive lipider, proteiner, DNA / RNA och kolhydrater, kan detekteras i den celltysta regionen av Raman-spektrumet 20,21,22,25,26,27. Med två synkroniserade laserpulser kan C-D-bindningar av nyligen syntetiserade lipider och proteiner visas på enskilda celler via hyperspektral avbildning (HSI) utan att extrahera eller märka dem med cytotoxiska medel. Dessutom har SRS-mikroskopi förmågan att konstruera tredimensionella (3D) modeller av utvalda regioner av intresse för biologiska prover genom att fånga och kombinera en uppsättning tvärsnittsbilder22,26. Med hyperspektral och 3D-volymetrisk avbildning kan DO-SRS erhålla rumsliga fördelningar av nyligen syntetiserade makromolekyler i enskilda celler, tillsammans med den typ av organeller som underlättar processen att främja cancertillväxt enligt AAA-förordning22. Vidare kan vi med hjälp av 2PEF erhålla autofluorescenssignaler av flavin och nikotinamidadenindinukleotid (NADH) med hög upplösning, djupt penetrationsdjup och lågnivåskador i biologiska prover21,23,24. Flavin och NADH autofluorescenssignaler har använts för att karakterisera redoxhomeostas och lipidperoxidation i cancerceller22,26. Kopplingen mellan DO-SRS och 2PEF ger inte bara subcellulär analys av AAA-reglerad metabolisk dynamik i cancerceller med hög rumslig fördelning, kemisk specificitetsinformation och minimal provberedning, utan metoden minskar också behovet av att extrahera eller märka endogena molekyler med toxiska reagens. I detta protokoll presenterar vi först procedurerna förD2O– och aminosyrapreparat samt cancercellodling. Därefter visar vi protokollen för DO-SRS-avbildning och 2PEF-avbildning. Slutligen presenterar vi de representativa resultaten av SRS- och 2PEF-avbildning, som visar AAA-reglerade metaboliska förändringar av lipider och protein, och redoxkvotförändringar i cancerceller. En detaljerad illustration av processen markeras i figur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
DO-SRS och 2PEF-avbildning har tillämpats för att undersöka metabolisk dynamik i olika ex vivo-modeller, inklusive Drosophila och humana vävnader 21,22,23,24,26,27,33. Bildmodaliteten som används i denna studie integrerar DO-SRS- och 2PEF-mikroskopi, vilket kan överträffa and…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Yajuan Li och Anthony Fung för deras tekniska support och Fraley-labbet för cellinjen. Vi erkänner startfonderna från UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 och Hellman Fellow Award.
Materials
| 10 mL Serological Pipettes | Avantor (by VWR) | 75816-100 | https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100 |
| 15 mL Conical Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664 |
| 16% Formaldehyde, Methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28906 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906 |
| 24-well plate | Fisherbrand | FB0112929 | https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929 |
| 25 mm Syringe Filter, 2 μm PES | Foxx Life Sciences | 381-2216-OEM | https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 |
| 460 nm Filter Cube | Olympus | OCT-ET460/50M32 | |
| AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser Remote | Olympus | Supply power to the laser | |
| Band-pass Filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC Cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male/Male |
| Broadband Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 – 1100 nm |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | ||
| Cover Glass | Corning | 2850-25 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25 |
| DC power supply | TopWard | 6302D | |
| Dichroic Mount | Thorlabs | KM100CL | |
| Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent | mpbio | 196055 | https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf |
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate | MilliporeSigma | 38210000 | https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | MT10027CV | https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20 |
| FIJI ImageJ | ImageJ | Version 1.53t 24 August 2022 | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
| Heavy Water (Deuterium Oxide) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | 7732-18-5 | https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L |
| Hela Cells | ATCC | CCL-2 | https://www.atcc.org/products/ccl-2 |
| Hemocymeter | MilliporeSigma | Z359629-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB&gclsrc=aw.ds |
| High O.D. Bandpass Filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH300880340 | https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340 |
| HyClone Trypsin 0.25% (1x) Solution | Cytiva | SH30042.02 | https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445 |
| Integrated SRS Laser System | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted Laser-scanning Microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| IX3-CBH Control box | Olympus | Control the laser-scanning microscope | |
| Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| L-Phenalynine | Sigma | P5482-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482 |
| L-Tryptophan | Sigma | T8941-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941 |
| LabSpec 6 | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/ |
| Lock-In Amplifier | Zurich Instruments | N/A | https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier |
| Long-pass Dichroic Beam Splitter | Semrock | Di02-R980-25×36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MATLAB | MathWorks | Version: R2022b | https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-003 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003 |
| Microscopy Imaging Software | Olympus | FluoView | |
| MPLN 100x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364 |
| MPLN 50x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363 |
| NA Oil Condenser | Olympus | 6-U130 | https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser |
| Nail Polish | Wet n Wild | B01EO2G5O4 | https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0 |
| Origin | OriginLab | Origin 2022b (9.95) | https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782 |
| PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Thermofischer – Gibco | 14040117 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117 |
| Penicillin/Streptomycin | Thermofischer – Gibco | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Periscope Assembly | Thorlabs | RS99 | Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
| picoEmerald System | A.P.E | N/A | https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ |
| Shielded Box with BNC Connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female |
| Si Photodiode Detector | Home Built | N/A | DYI series |
| Silicon Wafer | |||
| Spacers | Grace Bio-Labs | 654008 | https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/ |
| Spontaneous Raman spectroscopy | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/ |
| Stimulated Raman Scattering Microscopy | Home Built | N/A | |
| Touch Panel Controller | Olympus | Control the X-Y direction of the laser-scanning microscope | |
| Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl) | Lonza | 17-942E | https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution" |
| Tweezers | Kaverme – Amazon | B07RNVXXV1 | https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1" |
| Two Photon Excitation Fluorescence Microscopy | Home Built | N/A | |
| Weighing Paper | VWR | 12578-165 | https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper |
| Zurich LabOneQ Software | Zurich Instruments | Control the Zurich lock-in amplifier |
Riferimenti
- Wu, G. Functional amino acids in nutrition and health. Amino Acids. 45 (3), 407-411 (2013).
- Wei, Z., Liu, X., Cheng, C., Yu, W., Yi, P. Metabolism of amino acids in cancer. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 603837 (2020).
- Parthasarathy, A., et al. A three-ring circus: Metabolism of the three proteogenic aromatic amino acids and their role in the health of plants and animals. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 29 (2018).
- Wang, H., et al. l-tryptophan activates mammalian target of rapamycin and enhances expression of tight junction proteins in intestinal porcine epithelial cells. The Journal of Nutrition. 145 (6), 1156-1162 (2015).
- Saxton, R. A., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 168 (6), 960-976 (2017).
- Mossmann, D., Park, S., Hall, M. N. mTOR signalling and cellular metabolism are mutual determinants in cancer. Nature Reviews. Cancer. 18 (12), 744-757 (2018).
- Kimura, T., Watanabe, Y. Tryptophan protects hepatocytes against reactive oxygen species-dependent cell death via multiple pathways including Nrf2-dependent gene induction. Amino Acids. 48 (5), 1263-1274 (2016).
- Ma, Q., et al. Dietary supplementation with aromatic amino acids decreased triglycerides and alleviated hepatic steatosis by stimulating bile acid synthesis in mice. Food and Function. 12 (1), 267-277 (2021).
- Cheng, C., et al. Treatment implications of natural compounds targeting lipid metabolism in nonalcoholic fatty liver disease, obesity and cancer. International Journal of Biological Sciences. 15 (8), 1654-1663 (2019).
- Lubes, G., Goodarzi, M. GC-MS based metabolomics used for the identification of cancer volatile organic compounds as biomarkers. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 147, 313-322 (2018).
- Di Gialleonardo, V., Wilson, D. M., Keshari, K. R. The potential of metabolic imaging. Seminars in Nuclear Medicine. 46 (1), 28-39 (2016).
- Bowman, A. P., et al. Evaluation of lipid coverage and high spatial resolution MALDI-imaging capabilities of oversampling combined with laser post-ionisation. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (10), 2277-2289 (2020).
- Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M. Imaging of lipid species by MALDI mass spectrometry. Journal of Lipid Research. 50, 317-322 (2009).
- Pirman, D. A., et al. Changes in cancer cell metabolism revealed by direct sample analysis with MALDI mass spectrometry. PLoS One. 8 (4), e61379 (2013).
- Li, Z., et al. Single-cell lipidomics with high structural specificity by mass spectrometry. Nature Communications. 12 (1), 2869 (2021).
- Miyagi, M., Kasumov, T. Monitoring the synthesis of biomolecules using mass spectrometry. Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 374 (2079), 20150378 (2016).
- Wang, T., Shogomori, H., Hara, M., Yamada, T., Kobayashi, T. Nanomechanical recognition of sphingomyelin-rich membrane domains by atomic force microscopy. Biochimica. 51 (1), 74-82 (2012).
- Fung, A. A., Shi, L. Mammalian cell and tissue imaging using Raman and coherent Raman microscopy. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 12 (6), e1501 (2020).
- Shi, L., Fung, A. A., Zhou, A. Advances in stimulated Raman scattering imaging for tissues and animals. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 11 (3), 1078-1101 (2021).
- Yamakoshi, H., et al. Imaging of EdU, an alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman microscopy. Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).
- Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
- Bagheri, P., Hoang, K., Fung, A. A., Hussain, S., Shi, L. Visualizing cancer cell metabolic dynamics regulated with aromatic amino acids using DO-SRS and 2PEF microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 779702 (2021).
- Li, Y., et al. Direct imaging of lipid metabolic changes in drosophila ovary during aging using DO-SRS microscopy. Frontiers in Aging. 2, 819903 (2022).
- Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. DO-SRS imaging of metabolic dynamics in aging Drosophila. Analyst. 146 (24), 7510-7519 (2021).
- Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
- Fung, A. A., et al. Imaging sub-cellular methionine and insulin interplay in triple negative breast cancer lipid droplet metabolism. Frontiers in Oncology. 12, 858017 (2022).
- Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. DO-SRS imaging of diet regulated metabolic activities in Drosophila during aging processes. Aging Cell. 21 (4), e13586 (2022).
- Shi, L., Wei, M., Min, W. Highly-multiplexed tissue imaging with raman dyes. Journal of Visualized Experiments. (182), e63547 (2022).
- Rysman, E., et al. De novo lipogenesis protects cancer cells from free radicals and chemotherapeutics by promoting membrane lipid saturation. Ricerca sul cancro. 70 (20), 8117-8126 (2010).
- Lisec, J., Jaeger, C., Rashid, R., Munir, R., Zaidi, N. Cancer cell lipid class homeostasis is altered under nutrient-deprivation but stable under hypoxia. BMC Cancer. 19 (1), 501 (2019).
- Thiam, A. R., Dugail, I. Lipid droplet-membrane contact sites – from protein binding to function. Journal of Cell Science. 132 (12), (2019).
- Schott, M. B., et al. Lipid droplet size directs lipolysis and lipophagy catabolism in hepatocytes. The Journal of Cell Biology. 218 (10), 3320-3335 (2019).
- Hoang, K., et al. Subcellular resolution DO-SRS and 2PEF imaging of metabolic dynamics regulated by L-methionine in amyotrophic lateral sclerosis. Optical Biopsy XXI: Toward Real-Time Spectroscopic Imaging and Diagnosis. SPIE. 1237303, 6-13 (2023).
- Jang, H., et al. Super-resolution stimulated Raman scattering microscopy with A-PoD. bioRxiv. , (2022).
- Li, Y., et al. Optical metabolic imaging uncovers sex- and diet-dependent lipid changes in aging drosophila brain. bioRxiv. , (2022).
- Zhang, W., et al. Multi-molecular hyperspectral PRM-SRS imaging. bioRxiv. , (2022).
- Wei, M., et al. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (14), 6608-6617 (2019).
- Chang, T., et al. Non-invasive monitoring of cell metabolism and lipid production in 3D engineered human adipose tissues using label-free multiphoton microscopy. Biomaterials. 34 (34), 8607-8616 (2013).
- Leica TCS SP8 CARS CARS Microscope – Label Free Imaging. Leica Microsystems Available from: https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/downloads/ (2023)
