Questo protocollo descrive una metodologia per la preparazione di perle di lattice per saggi che utilizzano anticorpi IgY per la rilevazione dell'antigene.
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Articolo metodologico
Standardizzazione di un test citometrico a perline basato su anticorpi tuorlo d'uovo
In questo articolo
Sommario
Abstract
I dosaggi immunologici sono test importanti per l'individuazione di numerosi bersagli molecolari. Tra i metodi attualmente disponibili, il test citometrico a microsfere ha guadagnato importanza negli ultimi decenni. Ogni microsfera che viene letta dall'apparecchiatura rappresenta un evento di analisi della capacità di interazione tra le molecole in prova. Migliaia di questi eventi vengono letti in un unico saggio, garantendo così un'elevata precisione e riproducibilità del saggio. Questa metodologia può essere utilizzata anche nella validazione di nuovi input, come gli anticorpi IgY, per la diagnosi di malattie. Questi anticorpi si ottengono immunizzando i polli con l'antigene di interesse e quindi estraendo l'immunoglobulina dal tuorlo delle uova degli animali; Pertanto, questo è un metodo indolore e altamente produttivo per ottenere gli anticorpi. Oltre a una metodologia per la validazione ad alta precisione della capacità di riconoscimento degli anticorpi di questo test, questo documento presenta anche un metodo per estrarre questi anticorpi, determinare le migliori condizioni di accoppiamento per gli anticorpi e le perle di lattice e determinare la sensibilità del test.
Introduzione
Tra le tecniche di immunodosaggio finalizzate alla diagnosi delle malattie, il test citometrico a microsfere è emerso come un approccio altamente sensibile e affidabile, poiché consente l'analisi di migliaia di particelle in un unico test1. Questa tecnica, oltre ad avere un'elevata produttività e a consentire l'utilizzo di volumi minori di campioni, presenta anche una grande flessibilità, poiché consente la rilevazione di diverse molecole, come citochine, molecole di adesione, isotipi di anticorpi e proteine 2,3.
Per lo sviluppo di quest....
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Protocollo
NOTA: Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e gli strumenti utilizzati in questo protocollo.
1. Estrazione delle IgY dai tuorli d'uovo
- Igienizzazione delle uova
- Immergere le uova (appena deposte o fino a 4 giorni dopo la deposizione, del lignaggio Gallus gallus Dekalb White) in una soluzione diluita allo 0,2% di ipoclorito di sodio, sciacquare rapidamente sotto l'acqua corrente e strofinare delicatamente per un uso successivo o immediato.
NOTA: Se non utilizzato immediatamente, conservare a 4 °C per un massimo di 15 giorni.
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- Immergere le uova (appena deposte o fino a 4 giorni dopo la deposizione, del lignaggio Gallus gallus Dekalb White) in una soluzione diluita allo 0,2% di ipoclorito di sodio, sciacquare rapidamente sotto l'acqua corrente e strofinare delicatamente per un uso successivo o immediato.
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Risultati
La Figura 2 fornisce una rappresentazione grafica del processo di estrazione degli anticorpi IgY tramite acidificazione, seguita da separazione mediante acido caprilico (Figura 2).
Figura 2: Rappresentazione schematica della fase di estrazione degli anticorpi IgY.......
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Discussione
Il metodo di precipitazione dell'anticorpo IgY mediante riduzione del pH seguita da separazione lipidica mediante acido caprilico è efficiente nell'isolare gli anticorpi totali senza alcuna perdita di funzionalità. Il metodo qui proposto è più semplice ed economico di quello riportato da Redwan et al.11, che utilizzava anch'esso la precipitazione per acidificazione e acido caprilico ma con un protocollo più complesso e laborioso. Questo metodo presenta anche vantaggi rispetto alle metodologie comu.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere potenziali conflitti di interesse in relazione alla ricerca, alla paternità e alla pubblicazione di questo articolo.
Ringraziamenti
Ringraziamo il FIOCRUZ ("Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane - ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA"), il Programma post-laurea in Biotecnologie (PPGBIOTEC presso l'Universidade Federal do Amazonas - UFAM), il Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) e la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) per aver fornito le borse di studio. La Figura 2 e la Figura 4 sono state create con biorender.com.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anti-IgY di pollo (H+L), altamente adsorbito in modo incrociato, CF Anticorpo 488A prodotto nell'asino | Sigma-Aldrich | SAB4600031 | |
| Anti-topo IgG (H+L), F(ab′)2 | Sigma-Aldrich | SAB4600388 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | BF-FACSC2 | |
| BD FACSDiva CS& Perle di ricerca T (CS& BD | Biosciences | 655050 | |
| BD FACSDiva software 7.0 | BD Biosciences | 655677 | |
| Bio-Rad Protein Assay Concentrato di reagenti | coloranti Bio-Rad | #5000006 | |
| Albumina sierica bovina | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Acido caprilico | Sigma-Aldrich | O3907 | |
| Centrifuga 5702 R | Eppendorf | Z606936 | |
| cloruro 37% acido di grado molecolare | NEON | 02618 NEON | |
| CML lattice, 4% p/v | Invitrogen | C37253 | |
| Megafuge 8R | Thermo Scientific | TS-HM8R | |
| N-(3-dimetilamminopropil)-N′-etilcarbodiimmide cloridrato in polvere (EDC) | Sigma-Aldrich | E7750-1G | |
| N-idrossisuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672-25G | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Sigma-Aldrich | 1003335620 | |
| Idrossido di sodio | Acs Cientifica | P.10.0594.024.00.27 | |
| Ipoclorito di sodio | Acs Cientifica | R09211000 | |
| Thermo Mixer Caldo/Freddo | KASVI | K80-120R |
Riferimenti
- Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies. Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407(2019).
- de Figueiredo, A. M., Glória, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mariúba, L. A. M.
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Ristampe e permessi
