Her beskriver vi en protokol til ekstraktion af endogent tubulin fra pattedyrceller, som kan mangle eller indeholde specifikke mikrotubulusmodificerende enzymer, for at opnå mikrotubuli beriget til en specifik modifikation. Vi beskriver derefter, hvordan de ekstraherede mikrotubuli kan dekoreres med oprensede mikrotubulusbindende proteiner for at forberede gitter til kryo-elektronmikroskopi.
Mikrotubuli er en vigtig del af cytoskelettet og er involveret i intracellulær organisation, celledeling og migration. Afhængigt af de posttranslationelle modifikationer kan mikrotubuli danne komplekser med forskellige interaktive proteiner. Disse mikrotubulus-proteinkomplekser er ofte impliceret i menneskelige sygdomme. Forståelse af strukturen af sådanne komplekser er nyttig til belysning af deres virkningsmekanismer og kan studeres ved kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM). For at opnå sådanne komplekser til strukturelle undersøgelser er det vigtigt at ekstrahere mikrotubuli, der indeholder eller mangler specifikke posttranslationelle modifikationer. Her beskriver vi en forenklet protokol til ekstraktion af endogent tubulin fra genetisk modificerede pattedyrceller, der involverer mikrotubuluspolymerisering efterfulgt af sedimentering ved hjælp af ultracentrifugering. Det ekstraherede tubulin kan derefter bruges til at fremstille kryo-elektronmikroskopgitter med mikrotubuli, der er bundet til et renset mikrotubulibindende protein af interesse. Som et eksempel demonstrerer vi ekstraktion af fuldt tyrosinerede mikrotubuli fra cellelinjer, der er konstrueret til at mangle de tre kendte tubulin-detyrosinerende enzymer. Disse mikrotubuli bruges derefter til at fremstille et proteinkompleks med enzymatisk inaktiv mikrotubulusassocieret tubulindelyserosinase på kryo-EM-gitter.
Mikrotubuli er en afgørende del af cytoskelettet; De er involveret i forskellige funktioner såsom cellemigration og deling, men bidrager også til intracellulær organisation. For at tilpasse sig forskellige funktionelle fedtstoffer interagerer mikrotubuli med en række mikrotubulusassocierede proteiner (MAP’er), enzymer og andre proteiner, som vi samlet vil henvise til som “mikrotubulus-interagerende proteiner.” Mikrotubulusbindingen af disse proteiner kan styres af forskellige tubulinmodifikationer, almindeligvis benævnt “tubulinkoden”1. Eksempler på denne præference er den mitotiske centromerassocierede kinesin (MCAK)2 og dynein-dynactin CAP-Gly-domænet af p1503, som fortrinsvis associeres med tyrosineret tubulin, mens kinesinmotorerne centromerassocieret protein E (CENP-E)4 og kinesin-25 foretrækker tubulin, der mangler den C-terminale tyrosin.
Mens en række forskellige metoder kan anvendes til at studere mikrotubuli-proteininteraktioner, bruges kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) ofte til at studere disse interaktioner ved næratomopløsning 6,7. I de senere år har kryo-EM-strukturer afsløret, hvor store motoriske proteiner som dynein 8,9,10 og kinesin 11, +TIP-proteiner som EB312,13 og MCAK 14, andre proteiner som Tau15,16 og endda små molekyler som paclitaxel, pelorusid og zampanolid 17 interagere med mikrotubuli. For at studere mikrotubuli-proteininteraktioner ekstraheres mikrotubuli typisk fra svinehjernen18. Efter dette udføres de fleste in vitro-undersøgelser, herunder cryo-EM-mikrotubulusstrukturer, ved hjælp af tubulin fra svinehjerne. Resultaterne af disse undersøgelser tilslører derfor betydningen af den heterogene karakter af tubulinmodifikationer19 mellem væv og celletyper. Dette skaber et særligt problem, når man undersøger et protein, der kræver eller foretrækker en specifik modifikation for at binde til mikrotubuli. Dette kan illustreres med tyrosineret tubulin, substratet for mikrotubulus detyrosinase MATCAP.
Detyrosination er en tubulinmodifikation, hvor den C-terminale aminosyretyrosin af α-tubulin mangler, hvilket er forbundet med mitotisk, hjerte- og neuronal funktion20. Mens fuldt tyrosinerede mikrotubuli er det ideelle substrat for MATCAP, er dette stort set fraværende i kommercielt tilgængelige mikrotubuli fra svinehjernen på grund af funktionen af vasohibins 21,22 og MATCAP 23 detyrosinaser i dette væv 22,23,24,25,26. Selvom kommercielt tilgængelig HeLa-tubulin for det meste indeholder tyrosinerede mikrotubuli, kan detyrosination forekomme, og denne kilde til tubulin er derfor mindre egnet til at skabe en ensartet prøve til kryo-EM-analyse.
For at stimulere bindingen af MATCAP til mikrotubuli og skabe en homogen prøve til strukturel analyse søgte vi en kilde til mikrotubuli, der er fuldt tyrosineret. Til dette formål blev der skabt en MATCAP og vasohibin-mangelfuld cellelinje, som blev brugt til at ekstrahere fuldt tyrosinerede mikrotubuli. Ekstraktionsproceduren var baseret på veletablerede protokoller, der bruger gentagne cyklusser af polymerisering og depolymerisering af mikrotubuli til at ekstrahere tubulin fra hjernevæv eller celler 18,27,28,29,30, med kun et enkelt polymerisationstrin og centrifugering over en glycerolpude. Ved hjælp af MATCAP som eksempel demonstrerer vi derefter, hvordan disse mikrotubuli kan bruges til kryo-EM-undersøgelser. For at forberede kryo-EM-gitter beskrives en totrins applikationsprotokol ved en lav saltkoncentration. Metoderne i dette papir beskriver ekstraktionen af tilpasselige mikrotubuli i tilstrækkelige mængder og renhed til at udføre kryo-EM-analyse og giver en detaljeret protokol for, hvordan man bruger disse mikrotubuli til at skabe protein-mikrotubuluskomplekser på kryo-EM-gitter.
Denne metode beskriver, hvordan man hurtigt ekstraherer endogen tubulin fra cellelinjer og efterfølgende dekorerer disse mikrotubuli på kryo-EM-gitre. Mikrotubuli er temperaturfølsomme. De depolymeriserer i et koldt miljø og polymeriserer i et varmt miljø31. Det er derfor afgørende at udføre sonikering og clearance spin (trin 1.1-1.5) ved 4 ° C for at opløse tubulin. Hvis nogen faktorer stabiliserede mikrotubuli så godt, at de ikke ville depolymerisere i dette trin, ville disse mikrotubuli og de stabiliserende faktorer blive kasseret i pelleten efter den indledende clearance spin. Efter (re)polymerisering af mikrotubuli er det vigtigt at holde opløsningen, der indeholder de polymeriserede mikrotubuli, varm hele tiden. Vi ekstraherede mikrotubuli fra HCT116-celler, som mangler proteinerne VASH1, VASH2 og MATCAP. Andre cellelinjer såvel som væv kan bruges til at ekstrahere mikrotubuli29, selvom forurenende stoffer, tubulinisotyper og udbytte kan være meget forskellige fra det, der er beskrevet her. Overekspression plasmider, der indeholder modificerende enzymer, kan også bruges til at indføre specifikke tubulinmodifikationer.
Andre protokoller 18,27,28,29,30 bruger flere cyklusser af polymerisering og depolymerisering af mikrotubuli for at opnå mikrotubuli uden andre interagerende proteiner. Her har vi forenklet disse protokoller og polymeriserer kun mikrotubuli én gang. Det er muligt, at disse mikrotubuli på grund af denne enkelt polymerisation kan co-sedimentere med andre mikrotubulus-interagerende proteiner. Vi har imidlertid fundet ud af, at denne protokol giver tilstrækkeligt rene mikrotubuli til kryo-EM-formål. Hvis en renere prøve er nødvendig til specifikke assays, kan yderligere polymerisations- og depolymerisationscyklusser give en renere prøve, selvom dette kan være på bekostning af mikrotubulusudbyttet. I denne protokol brugte vi paclitaxel til at polymerisere mikrotubuli. Imidlertid kan paclitaxel bias mikrotubulusgitteret mod en bestemt drejning og stigning, hvilket kan forstyrre mikrotubulusaffiniteten af det pågældende protein. Andre mikrotubulusstabiliserende reagenser kan anvendes, hvis paclitaxel er uegnet; eksempler på disse reagenser er ikke-taxanmolekyler såsom pelorusid eller ikke-hydrolyserbare GTP-varianter såsom GMPCPP 17,32.
For strukturelt at undersøge proteiner, der binder til mikrotubuli på kryo-EM-gitter, skal man binde en tilstrækkelig mængde af proteinet af interesse for mikrotubuli. Et almindeligt forekommende problem er, at proteinkomplekser, der er stabile i opløsning, falder fra hinanden på nettet. For at danne proteinkomplekset på gitteret var det afgørende først at lægge mikrotubuli i lag og derefter påføre det mikrotubulusbindende protein med en lav saltkoncentration på det mikrotubulusbelagte gitter og dermed samle proteinkomplekset direkte på gitteret. Andre har ligeledes rapporteret en 33,34-protokol med lavt saltindhold og en totrinsansøgning 34,35,36-protokol til vellykket mikrotubulusdekoration. Det er sandsynligt, at en lavere saltkoncentration forvrider proteinkomplekset mod en mere stabil interaktion på grund af de nedsatte elektrostatiske ladninger. På grund af den lave saltkoncentration er proteinet af interesse imidlertid i fare for udfældning. Derfor anbefales det stærkt at holde proteinet på eller omkring fysiologisk relevante saltkoncentrationer indtil kort før forglasning af gitterene. Denne totrins applikationsprotokol forhindrer sandsynligvis proteinkomplekset i at falde fra hinanden under blotting- eller dykfrysningstrinnene. I denne protokol brugte vi Vitrobot. Imidlertid kan hurtigere vitrifikationsmetoder (VitroJet) eller brugen af blotfrie gitre (Puffalot) eller enheder, der har begge egenskaber (kamæleon), potentielt overvinde totrinsapplikationen, men disse er i øjeblikket ikke bredt tilgængelige til testning.
Den endelige opløsning af den rekonstruerede kryo-EM-densitet kan påvirkes af en række faktorer, herunder bevægelsen af det mikrotubulusbindende protein i forhold til mikrotubuli og det dekorationsniveau, der kan opnås. Højere mikrotubulusdekoration er sandsynligvis gavnlig for den endelige opløsning, der opnås i 3D-densitetsrekonstruktionen. Dette kan begrænses af nogle få faktorer, såsom den højeste proteinkoncentration, der opnås under oprensningen af det mikrotubulusbindende protein, den laveste saltkoncentration, som det mikrotubulus-interagerende protein kan modstå uden aggregering, og bindingstilstanden for det mikrotubulus-interagerende protein (f.eks. kan proteinet spænde over mere end en tubulindimer og dermed hindre et bindingsforhold på 1: 1). Selvom opløsningen af cryo-EM-rekonstruktionen kan blive kompromitteret af sparsomt dekorerede mikrotubuli, kan beregningsanalyse omgå mange problemer, som eksemplificeret ved en nyligt rapporteret mikrotubulus-protein-kompleks struktur, der var ekstremt sparsomt dekoreret8.
Den protokol, vi beskriver her, præsenterer en hurtig, billig metode til at opnå mikrotubuli, der er egnet til kryo-EM-formål. I modsætning til kommercielt tilgængeligt tubulin i svinehjernen er mikrotubuli afledt af MATCAP-mangelfulde og vasohibin-mangelfulde HCT116-celler fuldt tyrosinerede (figur 4). Kommercielt HeLa tubulin, et dyrt reagens, er i princippet relativt ensartet tyrosineret og indeholder lidt andre modifikationer4 såsom glutamylering, men batcher kan variere, og modifikation kunne kun opnås in vitro. En fordel ved at ekstrahere mikrotubuli fra specialfremstillede cellelinjer er den fleksibilitet, man har til at overudtrykke eller slette tubulinmodificerende enzymer, såsom tubulin detyrosinaser, for at skabe en mere homogen pulje af mikrotubuli. Dette kan gavne dekorationen og ensartetheden af cryo-EM-prøven og vil i sidste ende gavne letheden og kvaliteten af kryo-EM-densitetskortene og molekylære strukturer afledt af denne prøve.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker alle medlemmer af grupperne Sixma, Brummelkamp og Perrakis for deres frugtbare videnskabelige diskussioner og for at skabe et behageligt arbejdsmiljø, og specifikt takker vi Jan Sakoltchik (“person 2”) for at hjælpe med at bestemme proteinkoncentrationen afbildet i figur 3C. Vi vil også gerne takke NKI cryo-EM-faciliteten og det hollandske center for elektronnanoskopi (NeCEN) ved Leiden University for deres støtte. Dette arbejde blev støttet af NWO Vici tilskud 016.Vici.170.033 tildelt T.R.B.. A.P. og T.R.B. er Oncode-efterforskere og modtager finansiering fra NWO ENW (OCENW. M20.324). L.L. modtog støtte fra den østrigske videnskabsfond (FWF JB4448-B). Denne forskning blev støttet af et institutionelt tilskud fra den hollandske kræftforening og det hollandske ministerium for sundhed, velfærd og sport.
Material | |||
0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Cell culture |
10 cm plate | Falcon | 353003 | Cell culture |
15 cm plate | Thermo FisherScientific | 168381 | Cell culture |
50 mL tubes | Sarstedt | 62.547255 | Cell culture |
300 mesh quantifoil holey carbon copper grid R1.2/1.3 | Quantifoil Micro Tools | N1-C14nCu30-01 | Cryo-EM grid preparation |
Cell scrapers | Falcon | 353085 | Cell culture |
DMEM | Gibco | 41966-029 | Cell culture |
EDTA | Merck | 108418 | Cell culture |
EGTA | Sigma Aldrich | E3899 | Microtubule extraction |
Ethane gas | Cryo-EM grid preparation | ||
FCS | Serana | s-FBS-EU-015 | Cell culture |
Glycerol | VWR | 24.397.296 | Microtubule extraction |
GTP | Fisher Scientific | G8877-1G | Microtubule extraction |
HCT116 VASH1 VASH2 MATCAP KO cells | self made | Wild type HCT116 cells RRID: CVCL_0291 | Cell culture |
KOH | Merck | 1.05033 | Microtubule extraction |
MgCl2 | Merck | 105833 | Microtubule extraction |
Microtubule binding protein | self made | Cryo-EM grid preparation | |
Needle | BD microlance | 300600 | Microtubule extraction |
Paclitaxel | Santa Cruz Biotechnology | sc-212517 | caution toxic, microtubule extraction |
PBS | Fisher Scientific | BP399 | Cell culture |
Penicillin and streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100mL | Cell culture |
PIPES | Merck | P8203 | Microtubule extraction |
PMSF (in EtOH) | Roche | 16837091001 | Microtubule extraction |
SDS sample buffer | self made | Quality assessment | |
Syringe | BD plastipak | 309658 | Microtubule extraction |
Ultra protease tables mini | Fisher Scientific | NC0975224 | Microtubule extraction |
Whatman blotting paper | Whatman | 47000-100 | Cryo-EM grid preparation |
Equipment | |||
Flow hood | cell culture | ||
GloQube | Quorum | Cryo-EM grid preparation | |
Grid storage box | SWISSCI | 41018 | Cryo-EM grid storage |
Heating block, electric or metal | to warm the buffers | ||
Incubator, cell culture | NUAIR | cell culture | |
LN2 dewar | Cryo-EM grid storage | ||
Plunge-tweezers | Electron Microscopy Sciences | 0508-L5-PS | Cryo-EM grid preparation, hole drilled in top to fit the vitrobot |
Polystyrene box | to keep the buffers warm | ||
Sonicator | Qsonica | Q700 | Microtubule extraction |
Standard light microscope | Olympus | CKX 41 | Quality assessment |
TLA 100.3 rotor | Beckman Coulter | Microtubule extraction | |
TLA 120.2 rotor | Beckman Coulter | Microtubule extraction | |
Tubes for TLA 100.3 rotor | Beckman Coulter | 326819 | Microtubule extraction |
Tubes for TLA 120.2 rotor | Beckman Coulter | 347356 | Microtubule extraction |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Microtubule extraction |
Vitrobot | FEI, ThermoFischer Scientific | mark IV | Cryo-EM grid preparation |
Vitrobot polystyrene container assembly with metal ethane cup | ThermoFisher Scientific | 200703 | Cryo-EM grid preparation |
Water bath | cell culture |