מודלים של עכברים מהונדסים בגנום סומטי המשתמשים במיקרו-הזרקה ובאלקטרופורציה של Vivo
Summary
פרוטוקול זה מתאר מיקרו-הזרקה ואלקטרופורציה in vivo לעריכת גנום בתיווך קריספר מוגבלת אזורית באובידוקט העכבר.
Abstract
מודלים של עכברים מהונדסים גנטית (G-GEMM) סיפקו תובנה רבת ערך לגבי תפקוד הגן in vivo בהתפתחות, הומאוסטזיס ומחלות. עם זאת, הזמן והעלות הכרוכים בהקמת המושבה ותחזוקתה גבוהים. ההתקדמות האחרונה בעריכת גנום בתיווך קריספר אפשרה יצירת GEMMs סומטיים (S-GEMMs) על ידי התמקדות ישירה בתא/רקמה/איבר המעניין.
האובידוקט, או החצוצרה בבני אדם, נחשבת לרקמת המקור של סרטן השחלות הנפוץ ביותר, קרצינומה שחלתית סרוטית בדרגה גבוהה (HGSCs). HGSCs מתחילים באזור החצוצרה הדיסטלית לרחם, הממוקמת בסמוך לשחלה, אך לא בחצוצרה הפרוקסימלית. עם זאת, מודלים עכבריים מסורתיים של HGSC מכוונים את האובידוקט כולו, ולכן אינם משחזרים את המצב האנושי. אנו מציגים שיטה של מיקרו-הזרקה של תמיסת DNA, RNA או ריבונוקלאו פרוטאין (RNP) לתוך לומן האובידוקט ואלקטרופורציה in vivo כדי להתמקד בתאי אפיתל ריריים באזורים מוגבלים לאורך האובידוקט. ישנם מספר יתרונות של שיטה זו למידול סרטן, כגון: 1) יכולת הסתגלות גבוהה במיקוד האזור/רקמה/איבר ואזור האלקטרופורציה, 2) גמישות גבוהה בסוגי תאים ממוקדים (גמישות תאית) כאשר משתמשים בשילוב עם מקדמים ספציפיים לביטוי Cas9, 3) גמישות גבוהה במספר התאים המתחשמלים (תדר נמוך יחסית), 4) אין צורך בקו עכבר ספציפי (מידול מחלות חיסוניות), 5) גמישות גבוהה בשילוב מוטציות גנטיות, ו -6) אפשרות לעקוב אחר תאים מחושמלים כאשר משתמשים בשילוב עם קו כתב Cre. לפיכך, שיטה חסכונית זו משחזרת את התחלת הסרטן האנושי.
Introduction
החצוצרה, הנקראת אובידוקט בעכברים, היא מבנה צינורי המחבר את הרחם לשחלה. הוא ממלא תפקיד חיוני ברבייה של יונקים, ומספק את הסביבה להפריה פנימית ולהתפתחות טרום השרשה 1,2. למרות חשיבותו, מעט ידוע על תפקודו והומאוסטזיס, בין היתר בשל פיתוח טכניקות הפריה חוץ גופית העוקפות כל בעיית פוריות הקשורה לאיבר זה3. עם זאת, הוכר כי נגעים טרום סרטניים של קרצינומה שחלתית סרוסית בדרגה גבוהה (HGSC), היסטוטיפ אגרסיבי של סרטן השחלות המהווה כ -75% מקרצינומה בשחלות ו -85% ממקרי המוות הקשורים4, מוגבלים לאפיתל החצוצרה הדיסטלית 5,6,7,8 . זה מצביע על כך שלא כל התאים בגופנו רגישים באותה מידה לעלבונות אונקוגניים, אלא רק תאים ייחודיים/רגישים בכל רקמה/איבר הופכים לתא המקור בסרטן – מה שנקרא גמישות תאית9. לאורך קווים אלה, הוכח כי תאי האפיתל של החצוצרה הדיסטלית, הממוקמת בסמוך לשחלה, נבדלים משאר הצינור10,11. לפיכך, מודלים עכבריים מסורתיים של HGSC, המכוונים לכל התאים באובידוקט, אינם משחזרים את המצב האנושי. במחקר שנערך לאחרונה, השתמשנו בשילוב של עריכת גנום בתיווך קריספר, אלקטרופורציה של אובידוקט in vivo ומעקב אחר שושלת מבוססת Cre כדי לגרום בהצלחה ל- HGSC על ידי מוטציה של ארבעה גנים מדכאי גידול באובידוקט 12,13 של עכבר דיסטלי. כתב יד זה מציג פרוטוקול שלב אחר שלב המתאר הליך זה של מיקרו-הזרקה ואלקטרופורציה in vivo כדי להתמקד באפיתל הרירית של העכבר oviduct.
לשיטה זו מספר יתרונות. ניתן להתאים אותו לרקמות / איברים אחרים, כולל פרנכימה של איברים14. למרות שניתן להשתמש בגישות אחרות להעברת גנים in vivo כמו מערכות לנטי-ויראליות ואדנו-ויראליות כדי להשיג מיקוד ספציפי דומה לרקמות/איברים, אזור המיקוד מותאם בקלות רבה יותר באמצעות גדלים שונים של אלקטרודות מסוג טוויטר להעברה מבוססת אלקטרופורציה. בהתאם לריכוז ה-DNA/RNA/ריבונוקלאו פרוטאינים (RNPs), פרמטרי אלקטרופורציה וגודל האלקטרודות, ניתן לשנות את מספר התאים המתחשמלים. יתר על כן, ניתן לכוון לסוגי תאים ספציפיים כאשר משתמשים בהם בשילוב עם פרומוטורים לביטוי Cas9, ללא צורך מוחלט במודלים של עכברים מהונדסים גנטית (G-GEMM). בנוסף, בניגוד למערכות העברת נגיפים, אלקטרופורציה מאפשרת העברת פלסמיד מרובה לתאים בודדים ופחות אילוץ בהחדרת גודלDNA 15. בדיקות סקר In vivo של מוטציות גנטיות יכולות להתבצע בקלות יחסית גם בשל גמישות גבוהה זו. יתר על כן, תאים electroporated ניתן לעקוב או לעקוב כאשר שיטה זו משמשת בשילוב עם שורות כתב Cre כגון Tdtomato או קונפטי16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלבים מכריעים בפרוטוקול מפורט זה הם מיקרו-הזרקה של תמיסת DNA/RNA/RNP לתוך לומן האובידוקט ובקרה על חוזק ושטח האלקטרופורציה. דליפת תמיסת DNA/RNA/RNP במהלך מיקרו-הזרקה עלולה לגרום לטרנספקציה של אזורים/תאים לא רצויים. להתחשמלות עקבית ויעילה, עדיף למלא את לומן האובידוקט בתמיסה (איור 3C,D). הסיבה לכך היא שאזור האלקטרופורציה נשלט בעיקר על ידי גודל האלקטרודה ומיקומה. אלקטרופורציה חלשה מפחיתה את מספר התאים המתחשמלים, ואלקטרופורציה קשה עלולה לגרום להתחשמלות של תאים לא רצויים או לשבש את מבנה הרקמה. ניתן לשנות את מספר התאים המחושמלים על ידי התאמת ריכוז תמיסת DNA/RNA/RNP או פרמטרים של אלקטרופורציה. עם זאת, מכיוון שמתח גבוה/ייצור חום במהלך אלקטרופורציה עלול לפגוע ברקמה, יש לבדוק פרמטרים אלה לפני השימוש בעכברים חיים/מורדמים. לבסוף, בשל אופיו התובעני של הליך זה, מומלץ לתרגל חשיפה למערכת העיכול ומיקרו-הזרקה בעכברים מתים לפני ביצוע ניתוח זה בעכברים חיים/מורדמים.
ידוע כי גנים מרובים מעורבים בהתחלת סרטן, ולכן, שחזור אירוע זה דורש שינוי רב אללי של מספר גנים. בנוסף, ידוע גם כי לא כל התאים רגישים באותה מידה למוטציות אונקוגניות9. מודלים של סרטן, אם כן, דורשים קווי עכבר Cre ספציפיים כדי להשיג שליטה הדוקה על עלבונות אונקוגניים. עם זאת, זמינותם וסגולותם גורמת לאתגרים שונים, כולל השפעות ברקמות לא ממוקדות וקטלניות19. יתר על כן, G-GEMM מסורתיים כרוכים בעלויות תחזוקה גבוהות ודורשים זמן ליצירת קווי עכבר. הפיתוח של טכנולוגיית עריכת גנום CRISPR/Cas9 ושיפור העברת הגנים לתאים סומטיים ספציפיים אפשרו לנו להתגבר על בעיות אלה. בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטת העברת DNA/RNA/RNP למניפולציה של גנום סומטי שניתן להשתמש בה למידול סרטן, ללא צורך מוחלט בקווי עכבר ספציפיים12. על-ידי הזרקת תמיסות DNA/RNA/RNP לתוך הלומן ושימוש בגדלים שונים של אלקטרודות מסוג טוויטר להעברה מבוססת אלקטרופורציה, אזורים מוגבלים באפיתל הרירית של העכבר ממוקדים (איור 4A-F). זה שימושי במיוחד במידול ייזום של HGSCs שמקורם בקצה הדיסטלי של החצוצרה.
שיטת המיקרו-הזרקה ואלקטרופורציה in vivo המוצגת היא רב-תכליתית ביותר למיקוד רקמות/איברים באמצעות לומן. פרנכימה של איברים ניתנת למיקוד גם בשיטה זו14. גישות להעברת נגיפים, כמו מערכות לנטי-ויראליות ואדנו-ויראליות, יכולות לשמש גם למטרות דומות. עם זאת, היתרונות של אלקטרופורציה על פני גישות משלוח ויראלי הם: 1) העברת פלסמיד מרובים לתאים בודדים, 2) אין הגבלה על גודל הכנס15, ו -3) שליטה קלה על האזור ועיתוי המסירה. בנוסף, ניתן לשפר את ספציפיות המיקוד באמצעות מקדמים ספציפיים לשושלת. זה לפעמים קשה במערכות ויראליות בגלל המגבלה על אריזות ויראליות.
כטבעה של אלקטרופורציה, תאי אפיתל מחושמלים משולבים באופן אקראי עם תאים בריאים ולא ערוכים (איור 4G). עם זאת, פסיפס זה בתאים מהונדסים גנטית ולא מהונדסים יכול להיות יתרון לחקר התחלת סרטן, מכיוון שהוא משחזר את האופי הספורדי של התחלת סרטן מוקדמת בתוך מיקרו-סביבה חיסונית. ניתן להתאים את התדירות של תאים אלקטרופורטיים על ידי שינוי ריכוזי תמיסת DNA/RNA/RNP ו / או פרמטרים אלקטרופורציה. באמצעות עריכת גנים בתיווך CRISPR-Cas בשילוב עם הפרוטוקול המוצג, קל לסנן גנים מרובים וליצור דפוסים הטרוגניים של מוטציות/שילובים אלליים בגנים ממוקדים; זה שימושי במיוחד במידול סוגי סרטן המציגים מספר ניכר של שינויים גנומיים כמו HGSCs20,21. יתר על כן, על ידי ריצוף גנים ממוקדים במהלך התקדמות הסרטן, ניתן לעקוב אחר האבולוציה השבטית in vivo של גידולים וגרורות בעכברים חיסוניים12.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לקייטי טנג ולד”ר מתיו ג’יי פורד על אספקת פלסמידים המשמשים ליצירת תוצאות מייצגות ואופטימיזציה של פרוטוקולים. K.H. נתמך על ידי Fonds de recherche du Québec – Santé (FRQS) מענק דוקטורט, קרן דונור, דלתא Kappa Gamma World Fellowship, המרכז לחקר רבייה ופיתוח (CRRD), יו א ‘בורק, רולאנד ומרסל גוסלין, ואלכסנדר McFee סטודנטים לתואר שני.
Materials
| 0.22 µm sterile filter unit | LifeGene | SF0.22PES | |
| 1 mL syringe | Terumo Medical Corportation | SS-01T | |
| 1 mm tweezer-type electrodes | BEX CO., LTD | LF650P1 | |
| 3 mm tweezer-type electrodes | BEX CO., LTD | LF650P3 | |
| 30G x 1/2 Needle | BD | 305106 | Needle is attached to the 1 mL syringe when using injectable anesthetic or analgesic. |
| Adson forceps | Fisher Scientific | 10-000-451 | |
| Air-pressured syringe | BD | B302995 | Attached to the micromanipulator; as shown in Figure 2B |
| Analgesic | – | – | Carprofen, dose: 5mg/kg. |
| Antiseptic | Cardinal Health | OMEL0000017 | Baxedin: 2% chlorhexidine in 70% isopropyl alcohol |
| Avertin (2,2,2-tribromoethanol) – Anesthetic | Sigma Aldrich | T48402-25G | |
| Clamp mount micromanipulator | AD Instruments | MM-33 | |
| Curved serrated forceps | Fisher Scientific | NC0696845 | |
| Dissecting microscope | Zeiss | SteREO Discovery.V8 | Apochromat S, 0.63X, FWD 107mm. Attached KL 200 LED for top light, labelled as light source in Figure 2B. |
| Eye lubricant | Alcon | – | Systane ointment (Lubricant eye ointment) |
| Glass capillary needles | Sutter Instrument Co. | B100–50-10 | Outside diameter: 1 mm, inside diameter: 0.5 mm, length: 10 cm |
| Hartman hemostats | Fisher Scientific | 50-822-711 | |
| Heating pad/disc | – | – | SnuggleSafe Pet Bed Microwave Heating Pad was used in this protocol. Microwave for 2-5min, and test with back of gloved hand. |
| Magnetic Mount for micromanipulator | AD Instruments | MB-B | Used to keep the clamp mount micromanipulator stable and upright during injection. |
| Micro bulldog clamp | Fisher Scientific | 50-822-230 | 3 cm |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | P-97 Flaming/Brown type micropipette puller. Program used: P = 500, Heat = 576, PULL = 50, VEL = 80, DEL = 70 |
| Petri dish | Fisher Scientific | 263991 | Autoclaved/sterile glass petridishes can also be used. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic Inc. | PD8117 | 10X PBS was diluted to 1X with DI water. Autoclave before use. |
| Pulse generator/Electroporator | BEX CO., LTD | CUY21 EDIT II | Electroporation settings: 30 V, 3 pulses, 1 s interval, P. length = 50 ms, unipolar |
| Rosa-LSLtdTomato mice | The Jackson Laboratory | 7914 | Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J |
| Sharp-blunt dissection scissors | Fisher Scientific | 28251 | |
| Sharp-pointed dissecting scissors | Fisher Scientific | SDI130 | |
| Shaver | – | – | Hair removal cream can also be used. |
| Silk braided sutures | Ethicon | 682G | 3/8 circle, gauge: 5-0, needle size: 18 mm, thread length: 75 cm. Staples can also be used. |
| Tapered ultrafine tip forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Thin absorbent paper | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Kimwipes |
| Trypan blue | STEMCELL Technologies | 7050 | Filtered using 0.22 µm sterile filter before use for microinjection. |
Riferimenti
- Avilés, M., Coy, P., Rizos, D. The oviduct: A key organ for the success of early reproductive events. Animal Frontiers. 5 (1), 25-31 (2015).
- Li, S., Winuthayanon, W. Oviduct: roles in fertilization and early embryo development. The Journal of Endocrinology. 232 (1), R1-R26 (2017).
- Briceag, I., et al. Fallopian tubes–literature review of anatomy and etiology in female infertility. Journal of Medicine and Life. 8 (2), 129-131 (2015).
- Perets, R., et al. Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models. Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).
- Labidi-Galy, S. I., et al. High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube. Nature Communications. 8 (1), 1093 (2017).
- Shaw, P. A., Rouzbahman, M., Pizer, E. S., Pintilie, M., Begley, H. Candidate serous cancer precursors in fallopian tube epithelium of BRCA1/2 mutation carriers. Modern Pathology. 22 (9), 1133-1138 (2009).
- Soong, T. R., et al. Evidence for lineage continuity between early serous proliferations (ESPs) in the Fallopian tube and disseminated high-grade serous carcinomas. The Journal of Pathology. 246 (3), 344-351 (2018).
- Lee, Y., et al. A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube. The Journal of Pathology. 211 (1), 26-35 (2007).
- Puisieux, A., Pommier, R. M., Morel, A. P., Lavial, F. Cellular pliancy and the multistep process of tumorigenesis. Cancer Cell. 33 (2), 164-172 (2018).
- Harwalkar, K., et al. Anatomical and cellular heterogeneity in the mouse oviduct-its potential roles in reproduction and preimplantation development. Biology of Reproduction. 104 (6), 1249-1261 (2021).
- Ford, M. J., et al. Oviduct epithelial cells constitute two developmentally distinct lineages that are spatially separated along the distal-proximal axis. Cell Reports. 36 (10), 109677 (2021).
- Teng, K., et al. Modeling high-grade serous ovarian carcinoma using a combination of in vivo fallopian tube electroporation and CRISPR-Cas9-mediated genome editing. Ricerca sul cancro. 81 (20), 5147-5160 (2021).
- Ford, M. J., Yamanaka, Y. Reprogramming mouse oviduct epithelial cells using in vivo electroporation and CRISPR/Cas9-mediated genetic manipulation. Methods in Molecular Biology. 2429, 367-377 (2022).
- Maresch, R., et al. Multiplexed pancreatic genome engineering and cancer induction by transfection-based CRISPR/Cas9 delivery in mice. Nature Communications. 7, 10770 (2016).
- Braun, C. J., Adames, A. C., Saur, D., Rad, R. Tutorial: design and execution of CRISPR in vivo screens. Nature Protocols. 17 (9), 1903-1925 (2022).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Chazaud, C., Yamanaka, Y., Pawson, T., Rossant, J. Early lineage segregation between epiblast and primitive endoderm in mouse blastocysts through the Grb2-MAPK pathway. Developmental Cell. 10 (5), 615-624 (2006).
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nature Reviews. Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
- Kroeger Jr, P. T., Drapkin, R. Pathogenesis and heterogeneity of ovarian cancer. Current Opinion in Obstetrics & Gynecology. 29 (1), 26-34 (2017).
- Cancer Genome Atlas Research Network. Integrated genomic analyses of ovarian carcinoma. Nature. 474 (7353), 609-615 (2011).
