Neutrofil levetidsforlængelse med CLON-G og en in vitro spontan dødsanalyse

Summary

Denne protokol beskriver forberedelsen af CLON-G for at forlænge neutrofilens levetid til mere end 5 dage og giver en pålidelig procedure til evaluering af neutrofildød med flowcytometri og konfokal fluorescensmikroskopi.

Abstract

Den gennemsnitlige levetid for en neutrofil er mindre end 24 timer, hvilket begrænser grundforskning på neutrofiler og anvendelsen af neutrofile undersøgelser. Vores tidligere forskning viste, at flere veje kunne formidle neutrofilers spontane død. En cocktail blev udviklet ved samtidig at målrette mod disse veje, caspaser-lysosomal membranpermeabilisering-oxidant-necroptose-hæmning plus granulocytkolonistimulerende faktor (CLON-G), som forlængede neutrofilens levetid til mere end 5 dage uden signifikant at kompromittere neutrofilfunktionen. Samtidig blev der også udviklet en pålidelig og stabil protokol til vurdering og evaluering af neutrofildød. I dette arbejde viser vi, at CLON-G kan forlænge den neutrofile levetid in vitro til mere end 5 dage, og vi udviser forlængelse af neutrofilens levetid med FACS og konfokal fluorescensmikroskopi. Denne rapport introducerer procedurer til fremstilling af CLON-G og viser et in vitro spontant dødsassay af neutrofiler, som kan bruges til undersøgelse af neutrofiler og til efterfølgende forhør af neutrofildød, hvilket giver en pålidelig ressource for neutrofilsamfundet.

Introduction

Neutrofiler er kendt for at omfatte et arsenal af rigelige cytoplasmatiske granulater, nicotinamid-adenin-dinukleotidphosphat (NADPH) oxidase, antimikrobielle enzymer og forskellige organeller, der forsvarer sig mod invaderende mikrober; Derudover er de meget bevægelige og er de første celler, der rekrutteres til inflammationsstedet, hvilket betyder, at neutrofiler er den første forsvarslinje for det medfødte immunsystem ^1,2. Granulocyttransfusionsterapi er derfor blevet en lovende klinisk behandling for neutropeni-relaterede infektioner for forbigående at øge neutrofilimmunitet ^3,4,5. Nylige opdagelser har tydeligt vist, at neutrofiler også fungerer som multifacetterede effektorer i mange fysiopatologiske scenarier⁶. Den gennemsnitlige levetid for en neutrofil er mindre end 24 timer, og derfor er grundforskning i neutrofiler og anvendelse af neutrofile undersøgelser enormt vanskelig på grund af begrænsningerne relateret til stabil genetisk manipulation og langtidsopbevaring 7,8,9,10,11 . Der er nogle cellelinjer, der delvist kan fremvise nogle neutrofile funktioner, såsom HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 og inducerede pluripotente stamceller¹². Disse cellelinjer kan opnå effektiv genredigering og kryopræservering; De adskiller sig dog stadig ganske uhyre fra primære neutrofiler og kan derfor ikke trofast rekapitulere neutrofile funktioner¹³. Således er det meste af forskningen på dette område stadig afhængig af nyligt isolerede primære neutrofiler. Feltet er stadig afhængigt af at generere dyre og tidskrævende betingede knock-out-mus til at undersøge specifikke genfunktioner i neutrofiler, men der findes i øjeblikket ingen menneskelige modeller.

Efter at have lagt vores indsats i at udforske de heterogene processer, der er involveret i neutrofildød og de mange veje, der regulerer disse processer^14,15, blev en ny behandling kaldet CLON-G (caspases-lysosomal membranpermeabilisering-oxidant-necroptose-hæmning plus granulocytkolonistimulerende faktor) for nylig rapporteret ¹⁶. CLON-G består af Q-VD-oph (quinolyl-valyl-O-methylaspartyl-[-2,6-difluorofenoxy]-methylketon), Hsp70 (varmechokprotein 70), DFO (deferoxamin), NAC (N-acetylcystein), Nec-1’er (nekrostatin-1’er) og G-CSF (granulocytkolonistimulerende faktor). Neutrofil spontan død medieres af flere veje, herunder apoptose, nekrotose og pyroptose. Q-VD-oph hæmmer apoptose af neutrofiler som en pan-caspasehæmmer ved at målrette caspase 1, caspase 3, caspase 8 og caspase 9¹⁷. Neutrofil nekrotose er afhængig af en signalvej, der involverer receptorinteragerende proteinkinase-1 (RIPK1) og blandet afstamningskinase domænelignende protein (MLKL)¹⁸. Som en RIPK1-hæmmer Nec-1’er neutrofilers nekrotose. Hsp70 og DFO kan hæmme lysosomal membranpermeabilisering (LMP), hvilket kan inducere neutrofil apoptose¹⁹ og pyroptose²⁰. Reaktive iltarter (ROS) spiller afgørende roller i neutrofildød ved at formidle LMP¹⁹ og apoptose²¹ og ved at hæmme overlevelsessignaler²². Som en antioxidant, der kan reducere ROS akkumulering, NAC forsinkelser neutrofil død. Som en vækstfaktor aktiverer G-CSF neutrofile overlevelsessignaler og hæmmer calpain-induceret apoptose^23,24. Ved samtidig at målrette mod flere neutrofile spontane dødsveje kan den neutrofile levetid effektivt forlænges til mere end 5 dage uden at kompromittere deres funktion. CLON-G-behandling udvider mulighederne for neutrofilbevarelse, transport og genmanipulation, hvilket kan fremskynde forskning i neutrofilsamfundet. I mellemtiden, baseret på viden om neutrofil død, kan de aktuelt godkendte protokoller for celledødsanalyser forårsage uventet skade på neutrofiler¹⁴, så disse protokoller er blevet raffineret til at være mere passende til neutrofile undersøgelser. Denne rapport indeholder detaljerede protokoller for neutrofildyrkning med CLON-G og et di vitro-celledødsassay af museneutrofiler ved hjælp af flowcytometri og fluorescensbilleddannelse. CLON-G er effektiv på både mus og humane neutrofiler; Museksemplerne er dog demonstreret her for at forenkle denne protokol. Koncentrationen af NAC er 1 mM for museneutrofiler og 10 μM for humane neutrofiler. Hsp70 er artsspecifik og bør derfor anvendes i henhold til kilden til neutrofilen. For denne protokol er det ligegyldigt, om neutrofiler isoleres fra perifert blod eller knoglemarv, og hvordan de isoleres.

Til denne undersøgelse blev neutrofiler isoleret fra museknoglemarven for at opnå nok neutrofiler til forsøgene, da ca. 1 x 10 7-1,5 x 10⁷ neutrofiler kan opnås fra knoglemarven, mens kun 1 x 10 6 neutrofiler kan isoleres fra det perifere blod fra en enkelt 8-12 uger gammel C57BL/^6-mus (af begge køn). Gradientcentrifugering blev udført for at undgå mulig skade og aktivering fra den mekaniske stimulering af FACS-sortering eller MACS-sortering.

Protocol

Boston Children’s Hospital og State Key Laboratory of Experimental Hematology (SKLEH) Animal Care and Use Committee godkendte og overvågede alle procedurerne. Figur 1 viser et rutediagram over neutrofildyrkning med CLON-G og in vitro-dødsassayet . 1. Neutrofil levetidsforlængelse med CLON-G BEMÆRK: Alle de nævnte operationer og materialer skal være sterile. Sørg for, at alle opløsninger er godt blandet og…

Representative Results

Wright-Giemsa-farvede morfologi (figur 2A-D) og FACS-fænotyper (figur 2E-J) af de CLON-G-behandlede neutrofiler blev ikke påvirket. Levedygtigheden af de CLON-G-behandlede neutrofiler ved 24 timer var ca. 90%+ baseret på flowcytometrianalyse (figur 3) og fluorescerende billedassays (figur 4). Lavere levedygtighed kan skyldes forkert …

Discussion

Neutrofiler spiller afgørende roller i medfødt og adaptiv immunitet, og deres homeostase er tæt reguleret. Neutrofiler er de mest rigelige leukocytter i humant perifert blod, og de har en robust og hurtig omsætning. En sund voksen kan frigive 1 x 10⁹ neutrofiler / kg dagligt fra knoglemarven²⁸. Neutrofilers død er derfor blevet en af de gådefulde gåder på dette område, og der er gjort en stor indsats for bedre at forstå dem. Caspase 29,30,31,32, LMP 33, ROS^21…

Materials

0.2 µm syringe filter	Pall Corporation	4612	Filtrate prepared CLON-G components.
1.5 mL micro centrifuge tube	LABSELECT	MCT-001-150	Lab consumable.
15 mL Centrifuge Tubes	LABSELECT	CT-002-15	Lab consumable.
24 well cell culture plate	Falcon	351147	Neutrophil culture plate.
50 mL Centrifuge Tubes	LABSELECT	CT-002-50	Lab consumable.
BD LSRII	BD		Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	C4901	Assitant of Annexin-V binding  to phosphatidylserine.
Confocal microscope	Perkinelmer	UltraVIEW VOX	Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death.
Confocal plate	NEST	801001-20mm	Lab consumable for fluorescent image assay.
Counting beads	Thermo Fisher	C36950	Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death.
DFO	Sigma Aldrich	D9533	Component of CLON-G. LMP inhibitor.
Dimethyl sulfoxide ( DMSO)	Sigma Aldrich	D2650	Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s.
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099141C	Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply.
FITC-Annexin-V	BD	51-65874X	Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel.
Hsp70	Abcam	ab113187	Component of CLON-G. LMP inhibitor.
NAC	Sigma Aldrich	A9165	Component of CLON-G. Antioxidant.
Nec-1s	EMD Millipore	852391-15-2	Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor.
Penicillin-Streptomycin Solution (PS)	Gibco	15070063	Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination.
Propidium Iodide (PI)	BioLegend	421301	For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA  but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane.
Q-VD-oph	Selleck chem	S7311	Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor.
Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF)	Chugai Pharma China	GRANOCYTE	Component of CLON-G.  Promote neutrophil survival through Akt pathway.
Round-Bottom Polystyrene Tubes	Falcon	100-0102	Lab consumable for flow cytometry analysis.
RPMI1640	Gibco	C11875500BT	Component of neutrophil culture basic medium.
Saline	LEAGENE	R00641	Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Sodium hydroxide (NaOH)	FENG CHUAN	13-011-00029	pH adjustion for NAC.
Wright-Giemsa Stain Solution	Solarbio	G1020	Neutrophil cytospin staining.