Prolongation de la durée de vie des neutrophiles avec CLON-G et un test de mort spontanée in vitro

Summary

Ce protocole détaille la préparation de CLON-G pour prolonger la durée de vie des neutrophiles à plus de 5 jours et fournit une procédure fiable pour évaluer la mort des neutrophiles par cytométrie en flux et microscopie confocale à fluorescence.

Abstract

La durée de vie moyenne d’un neutrophile est inférieure à 24 h, ce qui limite la recherche fondamentale sur les neutrophiles et l’application des études sur les neutrophiles. Nos recherches antérieures ont indiqué que de multiples voies pourraient intervenir dans la mort spontanée des neutrophiles. Un cocktail a été développé en ciblant simultanément ces voies, les caspases-perméabilisation-inhibition de la nécroptose de la membrane lysosomale et le facteur de stimulation des colonies de granulocytes (CLON-G), qui a prolongé la durée de vie des neutrophiles à plus de 5 jours sans compromettre de manière significative la fonction des neutrophiles. Parallèlement, un protocole fiable et stable pour évaluer la mort des neutrophiles a également été élaboré. Dans ce travail, nous montrons que CLON-G peut prolonger la durée de vie des neutrophiles in vitro à plus de 5 jours, et nous présentons l’allongement de la durée de vie des neutrophiles avec FACS et la microscopie confocale à fluorescence. Ce rapport présente des procédures pour la préparation du CLON-G et présente un essai in vitro de mort spontanée des neutrophiles, qui peut être utilisé pour l’étude des neutrophiles et pour interroger ensuite la mort des neutrophiles, fournissant ainsi une ressource fiable pour la communauté des neutrophiles.

Introduction

Les neutrophiles sont connus pour comprendre un arsenal de granules cytoplasmiques abondants, de nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) oxydase, d’enzymes antimicrobiennes et de divers organites qui se défendent contre les microbes envahisseurs; De plus, ils sont très mobiles et sont les premières cellules recrutées sur le site de l’inflammation, ce qui signifie que les neutrophiles sont la première ligne de défense du système immunitaire inné ^1,2. La thérapie transfusionnelle de granulocytes est donc devenue un traitement clinique prometteur pour les infections liées à la neutropénie afin de renforcer transitoirement l’immunité des neutrophiles ^3,4,5. Des découvertes récentes ont clairement montré que les neutrophiles fonctionnent également comme effecteurs multifaces dans de nombreux scénarios physiopathologiques⁶. La durée de vie moyenne d’un neutrophile est inférieure à 24 heures et, par conséquent, la recherche fondamentale sur les neutrophiles et l’application d’études sur les neutrophiles sont extrêmement difficiles en raison des limites liées à la manipulation génétique stable et au stockage à long terme 7,8,9,10,11 . Certaines lignées cellulaires peuvent présenter partiellement certaines fonctions neutrophiles, telles que HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 et les cellules souches pluripotentes induites¹². Ces lignées cellulaires peuvent réaliser une édition et une cryoconservation efficaces des gènes; Cependant, ils diffèrent encore énormément des neutrophiles primaires et, par conséquent, ne peuvent pas récapituler fidèlement les fonctions des neutrophiles¹³. Ainsi, la plupart des recherches dans ce domaine reposent encore sur des neutrophiles primaires fraîchement isolés. Le domaine repose toujours sur la génération de souris knock-out conditionnelles coûteuses et chronophages pour étudier des fonctions génétiques spécifiques dans les neutrophiles, mais aucun modèle humain n’existe actuellement.

Après avoir déployé nos efforts pour explorer les processus hétérogènes impliqués dans la mort des neutrophiles et les multiples voies qui régulent ces processus^14,15, un nouveau traitement appelé CLON-G (caspases-perméabilisation de la membrane lysosomale-oxydant-inhibition de la nécroptose plus facteur de stimulation des colonies de granulocytes) a récemment été rapporté ¹⁶. CLON-G se compose de Q-VD-oph (quinolyl-valyl-O-méthylaspartyl-[-2,6-difluorophénoxy]-méthylcétone), Hsp70 (protéine de choc thermique 70), DFO (déféroxamine), NAC (N-acétylcystéine), Nec-1s (nécrostatine-1s) et G-CSF (facteur de stimulation des colonies de granulocytes). La mort spontanée des neutrophiles est médiée par de multiples voies, y compris l’apoptose, la nécroptose et la pyroptose. La Q-VD-oph inhibe l’apoptose des neutrophiles en tant qu’inhibiteur de pan-caspase en ciblant la caspase 1, la caspase 3, la caspase 8 et la caspase 9¹⁷. La nécroptose neutrophile dépend d’une voie de signalisation impliquant la protéine kinase-1 interagissant avec les récepteurs (RIPK1) et la protéine mixte de type domaine kinase de lignée (MLKL)¹⁸. En tant qu’inhibiteur de RIPK1, les Nec-1 inhibent la nécroptose des neutrophiles. Hsp70 et DFO peuvent inhiber la perméabilisation de la membrane lysosomale (LMP), ce qui pourrait induire l’apoptose des neutrophiles¹⁹ et la pyroptose²⁰. Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) jouent un rôle vital dans la mort des neutrophiles en médiant LMP¹⁹ et apoptose²¹ et en inhibant les signaux de survie²². En tant qu’antioxydant pouvant réduire l’accumulation de ROS, la NAC retarde la mort des neutrophiles. En tant que facteur de croissance, le G-CSF active les signaux de survie des neutrophiles et inhibe l’apoptose induite par la calpaïne^23,24. En ciblant simultanément plusieurs voies de mort spontanée des neutrophiles, la durée de vie des neutrophiles peut être prolongée efficacement à plus de 5 jours sans compromettre leur fonction. Le traitement par CLON-G élargit les possibilités de préservation, de transport et de manipulation génétique des neutrophiles, ce qui peut accélérer la recherche dans la communauté des neutrophiles. Pendant ce temps, sur la base de la connaissance de la mort des neutrophiles, les protocoles actuellement approuvés pour les tests de mort cellulaire peuvent causer des dommages inattendus aux neutrophiles¹⁴, de sorte que ces protocoles ont été affinés pour être plus appropriés pour les études sur les neutrophiles. Ce rapport fournit des protocoles détaillés pour la culture des neutrophiles avec CLON-G et un test in vitro de mort cellulaire des neutrophiles de souris utilisant la cytométrie en flux et l’imagerie par fluorescence. CLON-G est efficace sur les neutrophiles de souris et d’humains; Cependant, les échantillons de souris sont présentés ici pour simplifier ce protocole. La concentration de NAC est de 1 mM pour les neutrophiles de souris et de 10 μM pour les neutrophiles humains. Hsp70 est spécifique à l’espèce et, par conséquent, devrait être utilisé en fonction de la source du neutrophile. Pour ce protocole, peu importe que les neutrophiles soient isolés du sang périphérique ou de la moelle osseuse et comment ils sont isolés.

Pour la présente étude, les neutrophiles ont été isolés de la moelle osseuse de souris pour obtenir suffisamment de neutrophiles pour les expériences, car environ 1 x 10 7-1,5 x 10⁷ neutrophiles peuvent être obtenus à partir de la moelle osseuse, tandis que seulement 1 x 10 6 neutrophiles peuvent être isolés du sang périphérique d’une seule souris C57BL/⁶ âgée de 8 à 12 semaines (de l’un ou l’autre sexe). La centrifugation par gradient a été réalisée pour éviter d’éventuels dommages et activations dus à la stimulation mécanique du tri FACS ou du tri MACS.

Protocol

Le comité de soin et d’utilisation des animaux du Boston Children’s Hospital et du State Key Laboratory of Experimental Hematology (SKLEH) a approuvé et surveillé toutes les procédures. La figure 1 illustre un organigramme de la culture des neutrophiles avec CLON-G et le test de mort in vitro . 1. Prolongation de la durée de vie des neutrophiles avec CLON-G NOTE: Toutes les opérations et le matériel me…

Representative Results

La morphologie colorée Wright-Giemsa (Figure 2A-D) et les phénotypes FACS (Figure 2E-J) des neutrophiles traités par CLON-G n’ont pas été affectés. La viabilité des neutrophiles traités par CLON-G à 24 heures était d’environ 90%+ d’après l’analyse par cytométrie en flux (Figure 3) et les essais par image fluorescente (Figure …

Discussion

Les neutrophiles jouent un rôle essentiel dans l’immunité innée et adaptative, et leur homéostasie est étroitement réglementée. Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants dans le sang périphérique humain, et ils ont un renouvellement robuste et rapide. Un adulte en bonne santé peut libérer 1 x 10⁹ neutrophiles / kg par jour de la moelle osseuse²⁸. La mort des neutrophiles est donc devenue l’une des énigmes déroutantes de ce domaine, et beaucoup d’efforts …

Materials

0.2 µm syringe filter	Pall Corporation	4612	Filtrate prepared CLON-G components.
1.5 mL micro centrifuge tube	LABSELECT	MCT-001-150	Lab consumable.
15 mL Centrifuge Tubes	LABSELECT	CT-002-15	Lab consumable.
24 well cell culture plate	Falcon	351147	Neutrophil culture plate.
50 mL Centrifuge Tubes	LABSELECT	CT-002-50	Lab consumable.
BD LSRII	BD		Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	C4901	Assitant of Annexin-V binding  to phosphatidylserine.
Confocal microscope	Perkinelmer	UltraVIEW VOX	Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death.
Confocal plate	NEST	801001-20mm	Lab consumable for fluorescent image assay.
Counting beads	Thermo Fisher	C36950	Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death.
DFO	Sigma Aldrich	D9533	Component of CLON-G. LMP inhibitor.
Dimethyl sulfoxide ( DMSO)	Sigma Aldrich	D2650	Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s.
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099141C	Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply.
FITC-Annexin-V	BD	51-65874X	Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel.
Hsp70	Abcam	ab113187	Component of CLON-G. LMP inhibitor.
NAC	Sigma Aldrich	A9165	Component of CLON-G. Antioxidant.
Nec-1s	EMD Millipore	852391-15-2	Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor.
Penicillin-Streptomycin Solution (PS)	Gibco	15070063	Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination.
Propidium Iodide (PI)	BioLegend	421301	For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA  but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane.
Q-VD-oph	Selleck chem	S7311	Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor.
Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF)	Chugai Pharma China	GRANOCYTE	Component of CLON-G.  Promote neutrophil survival through Akt pathway.
Round-Bottom Polystyrene Tubes	Falcon	100-0102	Lab consumable for flow cytometry analysis.
RPMI1640	Gibco	C11875500BT	Component of neutrophil culture basic medium.
Saline	LEAGENE	R00641	Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Sodium hydroxide (NaOH)	FENG CHUAN	13-011-00029	pH adjustion for NAC.
Wright-Giemsa Stain Solution	Solarbio	G1020	Neutrophil cytospin staining.