JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

הארכת תוחלת החיים של נויטרופילים עם CLON-G ובדיקת מוות ספונטני במבחנה

Published: May 12, 2023
doi:
10.3791/65132
, , , , , ,
1State Key Laboratory of Experimental Hematology, National Clinical Research Center for Blood Diseases, Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, Institute of Hematology & Blood Diseases Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2Tianjin Institutes of Health Science, 3Sichuan Provincial People’s Hospital,University of Electronic Science and Technology of China, 4Haihe Laboratory of Cell Ecosystem,Tianjin Medical University, 5Joint Program in Transfusion Medicine, Department of Pathology, Harvard Medical School; Division of Blood Bank, Department of Laboratory Medicine, The Stem Cell Program, Boston Children’s Hospital,Dana-Farber /Harvard Cancer Center

Summary

פרוטוקול זה מפרט את הכנת CLON-G להארכת תוחלת החיים של נויטרופילים ליותר מ-5 ימים ומספק הליך אמין להערכת מוות נויטרופילים באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי.

Abstract

תוחלת החיים הממוצעת של נויטרופילים היא פחות מ-24 שעות, מה שמגביל את המחקר הבסיסי על נויטרופילים ואת היישום של מחקרי נויטרופילים. המחקר הקודם שלנו הצביע על כך שמסלולים מרובים יכולים לתווך את המוות הספונטני של נויטרופילים. קוקטייל פותח על ידי התמקדות בו זמנית במסלולים אלה, עיכוב קספזות-ליזוזומליות של קרום החדירה-חמצון-נקרופטוזיס בתוספת גורם מגרה מושבת גרנולוציטים (CLON-G), אשר האריך את תוחלת החיים של הנויטרופילים ליותר מ -5 ימים מבלי לפגוע באופן משמעותי בתפקוד הנויטרופילים. במקביל פותח גם פרוטוקול אמין ויציב להערכה והערכה של מוות נויטרופילים. בעבודה זו, אנו מראים כי CLON-G יכול להאריך את תוחלת החיים של נויטרופילים במבחנה ליותר מ -5 ימים, ואנו מציגים את התארכות תוחלת החיים של נויטרופילים באמצעות FACS ומיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי. דו”ח זה מציג נהלים להכנת CLON-G ומציג בדיקת מוות ספונטני במבחנה של נויטרופילים, אשר יכולה לשמש לחקר נויטרופילים ולאחר מכן לחקור מוות נויטרופילים, ובכך לספק משאב אמין לקהילת הנויטרופילים.

Introduction

נויטרופילים ידועים כמרכיבים ארסנל של גרגירים ציטופלזמיים בשפע, ניקוטין-אמיד אדנין די-נוקלאוטיד פוספט (NADPH) אוקסידאז, אנזימים אנטי-מיקרוביאליים ואברונים שונים המגנים מפני חיידקים פולשים; בנוסף, הם תנועתיים מאוד והם התאים הראשונים שגויסו לאתר הדלקת, כלומר נויטרופילים הם קו ההגנה הראשון של מערכת החיסון המולדת 1,2. טיפול בעירוי גרנולוציטים הפך לפיכך לטיפול קליני מבטיח לזיהומים הקשורים לנויטרופניה כדי להגביר באופן זמני את חסינות הנויטרופילים 3,4,5. תגליות אחרונות הראו בבירור כי נויטרופילים מתפקדים גם כמשפיעים רב-פנים בתרחישים פיזיולוגיים רבים6. תוחלת החיים הממוצעת של נויטרופיל היא פחות מ -24 שעות, ולכן, מחקר בסיסי על נויטרופילים ויישום של מחקרי נויטרופילים הם קשים מאוד בשל המגבלות הקשורות מניפולציה גנטית יציבה ואחסון לטווח ארוך 7,8,9,10,11 . ישנם כמה קווי תאים שיכולים להציג באופן חלקי כמה פונקציות נויטרופילים, כגון HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1, ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים12. קווי תאים אלה יכולים להשיג עריכה גנטית יעילה ושימור בהקפאה; עם זאת, הם עדיין שונים במידה עצומה מנויטרופילים ראשוניים, ולכן אינם יכולים לשחזר נאמנה פונקציות נויטרופילים13. לפיכך, רוב המחקר בתחום זה עדיין מסתמך על נויטרופילים ראשוניים טריים שבודדו. השדה עדיין מסתמך על יצירת עכברים מותנים יקרים וגוזלי זמן כדי לחקור תפקודים גנטיים ספציפיים בנויטרופילים, אך כיום לא קיימים מודלים אנושיים.

לאחר שהשקענו את מאמצינו לחקור את התהליכים ההטרוגניים המעורבים במוות של נויטרופילים ואת המסלולים המרובים המווסתים תהליכים אלה14,15, דווח לאחרונה על טיפול חדש המכונה CLON-G (caspases-lysosomal membrane permebilization-oxidant-necroptosis inhibition plus granulocyte colony-stimulating-stimulating factor) 16. CLON-G מורכב מ-Q-VD-oph (quinolyl-valyl-O-methylaspartyl-[-2,6-difluorophenoxy]-methyl ketone), Hsp70 (חלבון הלם חום 70), DFO (דפרוקסאמין), NAC (N-אצטיל-ציסטאין), Nec-1s (נקרוסטטין-1s) ו-G-CSF (גורם מגרה מושבת גרנולוציטים). מוות ספונטני של נויטרופילים מתווך על ידי מסלולים מרובים, כולל אפופטוזיס, נקרופטוזיס ופירופטוזיס. Q-VD-oph מעכב אפופטוזיס של נויטרופילים כמעכב פאן-קספז על ידי התמקדות בקספז 1, קספז 3, קספז 8 וקספז 917. נקרופטוזיס נויטרופיל תלוי במסלול איתות הכולל חלבון קינאז-1 (RIPK1) וחלבון דמוי תחום קינאז שושלת מעורבת (MLKL)18. כמעכב RIPK1, Nec-1s מעכב את הנקרופטוזיס של נויטרופילים. Hsp70 ו-DFO יכולים לעכב חדירות קרום ליזוזומלי (LMP), מה שעלול לגרום לאפופטוזיסנויטרופילים 19 ולפירופטוזיס20. מיני חמצן תגובתי (ROS) ממלאים תפקידים חיוניים במוות של נויטרופילים על ידי תיווך LMP19 ואפופטוזיס21 ועל ידי עיכוב אותות הישרדות22. כנוגד חמצון שיכול להפחית הצטברות ROS, NAC מעכב מוות של נויטרופילים. כגורם גדילה, G-CSF מפעיל אותות הישרדות נויטרופילים ומעכב אפופטוזיס23,24 המושרה על ידי calpain. על ידי התמקדות בו זמנית במסלולי מוות ספונטניים מרובים של נויטרופילים, ניתן להאריך ביעילות את תוחלת החיים של הנויטרופילים ליותר מ-5 ימים מבלי לפגוע בתפקודם. טיפול CLON-G מרחיב את האפשרויות של שימור נויטרופילים, שינוע ומניפולציה גנטית, אשר יכולים להאיץ את המחקר בקהילת הנויטרופילים. בינתיים, בהתבסס על הידע על מוות נויטרופילים, הפרוטוקולים המאושרים כיום לבדיקות מוות תאי יכולים לגרום נזק בלתי צפוי לנויטרופילים14, ולכן פרוטוקולים אלה שוכללו כך שיתאימו יותר למחקרי נויטרופילים. דו”ח זה מספק פרוטוקולים מפורטים לתרבית נויטרופילים עם CLON-G ובדיקת מוות תאי במבחנה של נויטרופילים בעכברים באמצעות ציטומטריית זרימה והדמיית פלואורסצנטיות. CLON-G יעיל הן על עכברים והן על נויטרופילים אנושיים; עם זאת, דגימות העכבר מודגמות כאן כדי לפשט פרוטוקול זה. הריכוז של NAC הוא 1 מילימטר עבור נויטרופילים של עכברים ו-10 מיקרומטר עבור נויטרופילים אנושיים. Hsp70 הוא ספציפי למין, ולכן יש להשתמש בו בהתאם למקור הנויטרופיל. עבור פרוטוקול זה, אין זה משנה אם נויטרופילים מבודדים מדם היקפי או מח עצם וכיצד הם מבודדים.

במחקר הנוכחי, נויטרופילים בודדו ממח עצם של עכבר כדי להשיג מספיק נויטרופילים לניסויים, שכן ניתן להשיג כ 1 x 10 7-1.5 x 107 נויטרופילים ממח העצם, בעוד שרק 1 x 10 6 נויטרופילים ניתן לבודד מהדם ההיקפי של עכבר יחיד בן 8-12 שבועות C57BL/6 (משני המינים). צנטריפוגה הדרגתית בוצעה כדי למנוע נזק והפעלה אפשריים מהגירוי המכני של מיון FACS או מיון MACS.

Protocol

בית החולים לילדים בבוסטון ומעבדת המפתח הממלכתית להמטולוגיה ניסויית (SKLEH) הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים אישרו ופיקחו על כל הנהלים. איור 1 מתאר תרשים זרימה של תרבית נויטרופילים עם CLON-G ומבחן המוות במבחנה . 1. הארכת תוחלת החיים של נויטרופילים עם CLON-G</strong…

Representative Results

המורפולוגיה המוכתמת של רייט-גימסה (איור 2A-D) ופנוטיפים של FACS (איור 2E-J) של הנויטרופילים שטופלו ב-CLON-G לא הושפעו. הכדאיות של נויטרופילים שטופלו ב-CLON-G תוך 24 שעות הייתה בערך 90%+ בהתבסס על ניתוח ציטומטריית זרימה (איור …

Discussion

נויטרופילים ממלאים תפקידים חיוניים בחסינות מולדת ונרכשת, וההומאוסטזיס שלהם מוסדר היטב. נויטרופילים הם הלויקוציטים הנפוצים ביותר בדם ההיקפי האנושי, ויש להם מחזור חזק ומהיר. מבוגר בריא יכול לשחרר 1 x 109 נויטרופילים / ק”ג מדי יום ממח העצם28. מותם של נויטרופילים הפך אפוא לאחת ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

פרויקט זה נתמך על ידי קרן החדשנות של מעבדת Haihe למערכת אקולוגית של תאים (22HHXBSS00036, 22HHXBSS00019), קרן החדשנות של האקדמיה הסינית למדעי הרפואה (CAMS) למדעי הרפואה (2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015), קרן המחקר המיוחדת לאוניברסיטאות מרכזיות, המכללה הרפואית פקין יוניון (3332022062) ותוכנית התמיכה במדע וטכנולוגיה של מחוז סצ’ואן (NO. 2021YJ0480).

Materials

0.2 µm syringe filter Pall Corporation 4612 Filtrate prepared CLON-G components.
1.5 mL micro centrifuge tube LABSELECT MCT-001-150 Lab consumable.
15 mL Centrifuge Tubes LABSELECT CT-002-15 Lab consumable.
24 well cell culture plate Falcon 351147 Neutrophil culture plate.
50 mL Centrifuge Tubes LABSELECT CT-002-50 Lab consumable.
BD LSRII BD Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Calcium chloride (CaCl2) Sigma Aldrich C4901 Assitant of Annexin-V binding  to phosphatidylserine.
Confocal microscope Perkinelmer UltraVIEW VOX Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death.
Confocal plate NEST 801001-20mm Lab consumable for fluorescent image assay.
Counting beads Thermo Fisher C36950 Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death.
DFO Sigma Aldrich D9533 Component of CLON-G. LMP inhibitor.
Dimethyl sulfoxide ( DMSO) Sigma Aldrich D2650 Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s.
Fetal Bovine Serum Gibco 10099141C Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply.
FITC-Annexin-V BD 51-65874X Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel.
Hsp70 Abcam ab113187 Component of CLON-G. LMP inhibitor.
NAC Sigma Aldrich A9165 Component of CLON-G. Antioxidant.
Nec-1s EMD Millipore 852391-15-2 Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor.
Penicillin-Streptomycin Solution (PS) Gibco 15070063 Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination.
Propidium Iodide (PI) BioLegend 421301 For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA  but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane.
Q-VD-oph Selleck chem S7311 Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor.
Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF) Chugai Pharma China GRANOCYTE Component of CLON-G.  Promote neutrophil survival through Akt pathway.
Round-Bottom Polystyrene Tubes Falcon 100-0102 Lab consumable for flow cytometry analysis.
RPMI1640 Gibco C11875500BT Component of neutrophil culture basic medium.
Saline LEAGENE R00641 Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Sodium hydroxide (NaOH) FENG CHUAN 13-011-00029 pH adjustion for NAC.
Wright-Giemsa Stain Solution Solarbio G1020 Neutrophil cytospin staining.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Segal, A. W. How neutrophils kill microbes. Annual Review of Immunology. 23, 197-223 (2005).
  2. Rosales, C. Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types. Frontiers in Physiology. 9, 113 (2018).
  3. Chung, S., Armstrong-Scott, O., Charlewood, R. Therapeutic granulocyte infusion for patients with severe neutropaenia and neutrophilic dysfunction: New Zealand experience. Vox Sanguinis. 117 (2), 220-226 (2021).
  4. Zhou, B., et al. Clinical outcome of granulocyte transfusion therapy for the treatment of refractory infection in neutropenic patients with hematological diseases. Annals of Hematology. 97 (11), 2061-2070 (2018).
  5. Covas, D. T., et al. Granulocyte transfusion combined with granulocyte colony stimulating factor in severe infection patients with severe aplastic anemia: A single center experience from China. PLoS One. 9 (2), e88148 (2014).
  6. Tecchio, C., Cassatella, M. A. Uncovering the multifaceted roles played by neutrophils in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 905-918 (2021).
  7. Lahoz-Beneytez, J., et al. Human neutrophil kinetics: Modeling of stable isotope labeling data supports short blood neutrophil half-lives. Blood. 127 (26), 3431-3438 (2016).
  8. Pillay, J., et al. In vivo labeling with 2H2O reveals a human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 116 (4), 625-627 (2010).
  9. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
  10. Tofts, P. S., Chevassut, T., Cutajar, M., Dowell, N. G., Peters, A. M. Doubts concerning the recently reported human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 117 (22), 6050-6052 (2011).
  11. McDonald, J. U., et al. In vivo functional analysis and genetic modification of in vitro-derived mouse neutrophils. FASEB Journal. 25 (6), 1972-1982 (2011).
  12. Pedruzzi, E., Fay, M., Elbim, C., Gaudry, M., Gougerot-Pocidalo, M. -. A. Differentiation of PLB-985 myeloid cells into mature neutrophils, shown by degranulation of terminally differentiated compartments in response to N-formyl peptide and priming of superoxide anion production by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. British Journal of Haematology. 117 (3), 719-726 (2002).
  13. Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: Cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
  14. Teng, Y., Luo, H. R., Kambara, H. Heterogeneity of neutrophil spontaneous death. American Journal of Hematology. 92 (8), E156-E159 (2017).
  15. Luo, H. R., Loison, F. Constitutive neutrophil apoptosis: Mechanisms and regulation. American Journal of Hematology. 83 (4), 288-295 (2008).
  16. Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
  17. Caserta, T. M. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis. 8, 345-352 (2003).
  18. Wang, X., Yousefi, S., Simon, H. U. Necroptosis and neutrophil-associated disorders. Cell Death and Disorders. 9 (2), 111 (2018).
  19. Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
  20. Kambara, H., et al. Gasdermin D exerts anti-inflammatory effects by promoting neutrophil death. Cell Reports. 22 (11), 2924-2936 (2018).
  21. Zhu, D., et al. Deactivation of phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate/Akt signaling mediates neutrophil spontaneous death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (40), 14836-14841 (2006).
  22. Xu, Y., Loison, F., Luo, H. R. Neutrophil spontaneous death is mediated by down-regulation of autocrine signaling through GPCR, PI3Kgamma, ROS, and actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 2950-2955 (2010).
  23. van Raam, B. J., Drewniak, A., Groenewold, V., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor delays neutrophil apoptosis by inhibition of calpains upstream of caspase-3. Blood. 112 (5), 2046-2054 (2008).
  24. Klein, J. B., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor delays neutrophil constitutive apoptosis through phosphoinositide 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase pathways. Journal of Immunology. 164 (8), 4286-4291 (2000).
  25. Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
  26. Xie, X., et al. Single-cell transcriptome profiling reveals neutrophil heterogeneity in homeostasis and infection. Nature Immunology. 21 (9), 1119-1133 (2020).
  27. Cosimo, E., et al. Inhibition of NF-kappaB-mediated signaling by the cyclin-dependent kinase inhibitor CR8 overcomes prosurvival stimuli to induce apoptosis in chronic lymphocytic leukemia cells. Clinical Cancer Research. 19 (9), 2393-2405 (2013).
  28. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
  29. Porter, A. G., Jänicke, R. U. Emerging roles of caspase-3 in apoptosis. Cell Death and Differentiation. 6 (2), 99-104 (1999).
  30. Scheel-Toellner, D., et al. Clustering of death receptors in lipid rafts initiates neutrophil spontaneous apoptosis. Biochemical Society Transactions. 32, 679-681 (2004).
  31. Geering, B., Simon, H. U. Peculiarities of cell death mechanisms in neutrophils. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1457-1469 (2011).
  32. Gabelloni, M. L., Trevani, A. S., Sabatté, J., Geffner, J. Mechanisms regulating neutrophil survival and cell death. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 423-437 (2013).
  33. Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
  34. Cho, Y. S., et al. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell. 137 (6), 1112-1123 (2009).
  35. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
  36. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
  37. Zhang, D. -. W., et al. RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis. Science. 325 (5938), 332-336 (2009).
  38. Wang, X., He, Z., Liu, H., Yousefi, S., Simon, H. -. U. Neutrophil necroptosis is triggered by ligation of adhesion molecules following GM-CSF priming. Journal of Immunology. 197 (10), 4090-4100 (2016).
  39. Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837 (2021).
  40. George, B., Bhattacharya, S., Chandy, M., Radhakrishnan, V. S., Sukumaran, R. Infections in hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) patients. Contemporary Bone Marrow Transplantation. , (2020).
  41. Lucena, C. M., et al. Pulmonary complications in hematopoietic SCT: A prospective study. Bone Marrow Transplant. 49 (10), 1293-1299 (2014).
  42. Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: A global perspective. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (10), 1143-1238 (2009).
  43. Wingard, J. R., Hiemenz, J. W., Jantz, M. A. How I manage pulmonary nodular lesions and nodular infiltrates in patients with hematologic malignancies or undergoing hematopoietic cell transplantation. Blood. 120 (9), 1791-1800 (2012).
  44. Wingard, J. R., Hsu, J., Hiemenz, J. W. Hematopoietic stem cell transplantation: An overview of infection risks and epidemiology. Infectious Disease Clinics of North America. 24 (2), 257-272 (2010).
  45. Netelenbos, T., et al. The burden of invasive infections in neutropenic patients: incidence, outcomes, and use of granulocyte transfusions. Transfusion. 59 (1), 160-168 (2019).

Tags

Keywords: Neutrophil LifespanCLON-GIn Vitro Spontaneous Death AssayNeutrophil PreservationNeutrophil TransportationNeutrophil Gene ManipulationFlow CytometryFluorescent ImagingCell Culture
check_url/it/65132?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Fan, Y., Teng, Y., Liu, F. t., Ma, F., Hsu, A. Y., Feng, S., Luo, H. R. Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay. J. Vis. Exp. (195), e65132, doi:10.3791/65132 (2023).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image