क्लोन-जी और एक इन विट्रो सहज मृत्यु परख के साथ न्यूट्रोफिल जीवनकाल विस्तार
Summary
यह प्रोटोकॉल न्यूट्रोफिल जीवनकाल को 5 दिनों से अधिक तक बढ़ाने के लिए क्लोन-जी की तैयारी का विवरण देता है और फ्लो साइटोमेट्री और कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ न्यूट्रोफिल मृत्यु के मूल्यांकन के लिए एक विश्वसनीय प्रक्रिया प्रदान करता है।
Abstract
एक न्यूट्रोफिल का औसत जीवनकाल 24 घंटे से कम है, जो न्यूट्रोफिल पर बुनियादी शोध और न्यूट्रोफिल अध्ययन के आवेदन को सीमित करता है। हमारे पिछले शोध ने संकेत दिया कि कई रास्ते न्यूट्रोफिल की सहज मृत्यु को मध्यस्थ कर सकते हैं। एक कॉकटेल इन मार्गों को एक साथ लक्षित करके विकसित किया गया था, कैसपेस-लाइसोसोमल झिल्ली परमेबिलाइजेशन-ऑक्सीडेंट-नेक्रोप्टोसिस निषेध प्लस ग्रैनुलोसाइट कॉलोनी-उत्तेजक कारक (क्लोन-जी), जिसने न्यूट्रोफिल फ़ंक्शन से समझौता किए बिना न्यूट्रोफिल जीवनकाल को 5 दिनों से अधिक समय तक बढ़ाया। समवर्ती रूप से, न्यूट्रोफिल मृत्यु का आकलन और मूल्यांकन करने के लिए एक विश्वसनीय और स्थिर प्रोटोकॉल भी विकसित किया गया था। इस काम में, हम दिखाते हैं कि क्लोन-जी विट्रो में न्यूट्रोफिल जीवनकाल को 5 दिनों से अधिक तक बढ़ा सकता है, और हम एफएसीएस और कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ न्यूट्रोफिल जीवनकाल को लंबा करने का प्रदर्शन करते हैं। यह रिपोर्ट क्लोन-जी की तैयारी के लिए प्रक्रियाओं का परिचय देती है और न्यूट्रोफिल की एक इन विट्रो सहज मृत्यु परख का प्रदर्शन करती है, जिसका उपयोग न्यूट्रोफिल के अध्ययन के लिए और बाद में न्यूट्रोफिल मृत्यु से पूछताछ के लिए किया जा सकता है, इस प्रकार न्यूट्रोफिल समुदाय के लिए एक विश्वसनीय संसाधन प्रदान किया जा सकता है।
Introduction
न्यूट्रोफिल को प्रचुर मात्रा में साइटोप्लाज्मिक ग्रैन्यूल, निकोटिनामाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड फॉस्फेट (एनएडीपीएच) ऑक्सीडेज, रोगाणुरोधी एंजाइम और विभिन्न ऑर्गेनेल के शस्त्रागार में शामिल किया जाता है जो हमलावर रोगाणुओं से बचाव करते हैं; इसके अतिरिक्त, वे अत्यधिक गतिशील हैं और सूजन स्थल पर भर्ती होने वाली पहली कोशिकाएं हैं, जिसका अर्थ है कि न्यूट्रोफिल जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली 1,2 की रक्षा की पहली पंक्ति है। इसलिए ग्रैनुलोसाइट ट्रांसफ्यूजन थेरेपी न्यूट्रोपेनिया से संबंधित संक्रमणों के लिए एक आशाजनक नैदानिक उपचार बन गई है जो क्षणिक रूप से न्यूट्रोफिल प्रतिरक्षा 3,4,5 को बढ़ावा देती है। हाल की खोजों ने स्पष्ट रूप से दिखाया है कि न्यूट्रोफिल कई फिजियोपैथोलॉजिकल परिदृश्यों में बहुआयामी प्रभावकोंके रूप में भी कार्य करते हैं। एक न्यूट्रोफिल का औसत जीवनकाल 24 घंटे से कम है, और इस प्रकार, न्यूट्रोफिल पर बुनियादी शोध और न्यूट्रोफिल अध्ययन का अनुप्रयोग स्थिर आनुवंशिक हेरफेर और दीर्घकालिक भंडारण 7,8,9,10,11 से संबंधित सीमाओं के कारण काफी कठिन है।. कुछ सेल लाइनें हैं जो आंशिक रूप से कुछ न्यूट्रोफिल कार्यों को प्रदर्शित कर सकती हैं, जैसे कि एचएल -60, पीएलबी -985, एनबी 4, कासुमी -1, और प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल12। ये सेल लाइनें प्रभावी जीन संपादन और क्रायोप्रिजर्वेशन प्राप्त कर सकती हैं; हालांकि, वे अभी भी प्राथमिक न्यूट्रोफिल से काफी भिन्न हैं और इस प्रकार, न्यूट्रोफिलकार्यों को ईमानदारी से पुन: उत्पन्न नहीं कर सकते हैं। इस प्रकार, इस क्षेत्र में अधिकांश शोध अभी भी ताजा पृथक प्राथमिक न्यूट्रोफिल पर निर्भर करते हैं। यह क्षेत्र अभी भी न्यूट्रोफिल में विशिष्ट जीन कार्यों की जांच के लिए महंगे और समय लेने वाले सशर्त नॉक-आउट चूहों को उत्पन्न करने पर निर्भर करता है, लेकिन वर्तमान में कोई मानव मॉडल मौजूद नहीं है।
न्यूट्रोफिल मृत्यु में शामिल विषम प्रक्रियाओं औरइन प्रक्रियाओं को नियंत्रित करने वाले कई मार्गों की खोज करने में हमारे प्रयास के बाद, क्लोन-जी (कैसपेस-लाइसोसोमल झिल्ली परमेबिलाइजेशन-ऑक्सीडेंट-नेक्रोप्टोसिस निषेध प्लस ग्रैनुलोसाइट कॉलोनी-उत्तेजक कारक) नामक एक नया उपचार हाल हीमें रिपोर्ट किया गया था।. क्लोन-जी में क्यू-वीडी-ओपीएच (क्विनोलिल-वैलिल-ओ-मिथाइलस्पार्टील-[-2,6-डिफ्लोरोफेनोक्सी]-मिथाइल कीटोन), एचएसपी 70 (हीट शॉक प्रोटीन 70), डीएफओ (डेफेरोक्सामाइन), एनएसी (एन-एसिटाइलसिस्टीन), नेक -1 एस (नेक्रोस्टैटिन -1 एस), और जी-सीएसएफ (ग्रैनुलोसाइट कॉलोनी-उत्तेजक कारक) शामिल हैं। न्यूट्रोफिल सहज मृत्यु को एपोप्टोसिस, नेक्रोप्टोसिस और पाइरोप्टोसिस सहित कई मार्गों द्वारा मध्यस्थ किया जाता है। क्यू-वीडी-ओपीएच कैसपेज़ 1, कैसपेज़ 3, कैसपेज़ 8 और कैसपेज़ 917 को लक्षित करके पैन-कैसपेज़ अवरोधक के रूप में न्यूट्रोफिल के एपोप्टोसिस को रोकता है। न्यूट्रोफिल नेक्रोप्टोसिस एक सिग्नलिंग मार्ग पर निर्भर है जिसमें रिसेप्टर-इंटरैक्टिंग प्रोटीन काइनेज -1 (आरआईपीके 1) और मिश्रित वंश काइनेज डोमेन जैसे प्रोटीन (एमएलकेएल)18 शामिल हैं। एक RIPK1 अवरोधक के रूप में, Nec-1s न्यूट्रोफिल के नेक्रोप्टोसिस को रोकता है। एचएसपी 70 और डीएफओ लाइसोसोमल मेम्ब्रेन परमेबिलाइजेशन (एलएमपी) को रोक सकते हैं, जो न्यूट्रोफिल एपोप्टोसिस19 और पाइरोप्टोसिस20 को प्रेरित कर सकता है। प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) एलएमपी19 और एपोप्टोसिस21 की मध्यस्थता करके और जीवित रहने के संकेतोंको बाधित करके न्यूट्रोफिल मृत्यु में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। एक एंटीऑक्सिडेंट के रूप में जो आरओएस संचय को कम कर सकता है, एनएसी न्यूट्रोफिल मृत्यु में देरी करता है। एक विकास कारक के रूप में, जी-सीएसएफ न्यूट्रोफिल अस्तित्व संकेतों को सक्रिय करता है और न्यूट्रोफिल प्रेरित एपोप्टोसिस23,24 को रोकता है। एक साथ कई न्यूट्रोफिल सहज मृत्यु मार्गों को लक्षित करके, न्यूट्रोफिल जीवनकाल को प्रभावी रूप से उनके कार्य से समझौता किए बिना 5 दिनों से अधिक तक बढ़ाया जा सकता है। क्लोन-जी उपचार न्यूट्रोफिल संरक्षण, परिवहन और जीन हेरफेर की संभावनाओं का विस्तार करता है, जो न्यूट्रोफिल समुदाय में अनुसंधान में तेजी ला सकता है। इस बीच, न्यूट्रोफिल मृत्यु के ज्ञान के आधार पर, कोशिका मृत्यु परख के लिए वर्तमान में अनुमोदित प्रोटोकॉल न्यूट्रोफिल14 को अप्रत्याशित नुकसान पहुंचा सकते हैं, इसलिए इन प्रोटोकॉल को न्यूट्रोफिल अध्ययन के लिए अधिक उपयुक्त होने के लिए परिष्कृत किया गया है। यह रिपोर्ट क्लोन-जी के साथ न्यूट्रोफिल संवर्धन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करती है और फ्लो साइटोमेट्री और फ्लोरेसेंस इमेजिंग का उपयोग करके माउस न्यूट्रोफिल की इन विट्रो सेल डेथ परख प्रदान करती है। क्लोन-जी माउस और मानव न्यूट्रोफिल दोनों पर प्रभावी है; हालाँकि, इस प्रोटोकॉल को सरल बनाने के लिए माउस नमूने यहां प्रदर्शित किए गए हैं। एनएसी की एकाग्रता माउस न्यूट्रोफिल के लिए 1 एमएम और मानव न्यूट्रोफिल के लिए 10 μM है। एचएसपी 70 प्रजाति-विशिष्ट है और इस प्रकार, न्यूट्रोफिल के स्रोत के अनुसार उपयोग किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल के लिए, इससे कोई फर्क नहीं पड़ता कि न्यूट्रोफिल परिधीय रक्त या अस्थि मज्जा से अलग हैं या नहीं और उन्हें कैसे अलग किया जाता है।
वर्तमान अध्ययन के लिए, प्रयोगों के लिए पर्याप्त न्यूट्रोफिल प्राप्त करने के लिए माउस अस्थि मज्जा से न्यूट्रोफिल को अलग किया गया था, क्योंकि अस्थि मज्जा से लगभग 1 x 10 7-1.5 x 107 न्यूट्रोफिल प्राप्त किए जा सकते हैं, जबकि केवल 1 x 10 6 न्यूट्रोफिल को 8-12 सप्ताह पुराने सी 57बीएल /6 माउस (या तो लिंग के) के परिधीय रक्त से अलग किया जा सकता है। एफएसीएस सॉर्टिंग या एमएसीएस सॉर्टिंग की यांत्रिक उत्तेजना से संभावित क्षति और सक्रियण से बचने के लिए ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन आयोजित किया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
न्यूट्रोफिल जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और उनके होमियोस्टैसिस को कसकर विनियमित किया जाता है। न्यूट्रोफिल मानव परिधीय रक्त में सबसे प्रचुर मात्रा में ल्यूकोसाइ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना को हैहे लेबोरेटरी ऑफ सेल इकोसिस्टम इनोवेशन फंड (22HHXBS00036, 22HHXBSS00019), चाइनीज एकेडमी ऑफ मेडिकल साइंसेज (CAMS) इनोवेशन फंड फॉर मेडिकल साइंसेज (2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015), केंद्रीय विश्वविद्यालयों के लिए विशेष अनुसंधान कोष, पेकिंग यूनियन मेडिकल कॉलेज (3332022062) और सिचुआन प्रांत के विज्ञान और प्रौद्योगिकी सहायता कार्यक्रम (2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.2 µm syringe filter | Pall Corporation | 4612 | Filtrate prepared CLON-G components. |
| 1.5 mL micro centrifuge tube | LABSELECT | MCT-001-150 | Lab consumable. |
| 15 mL Centrifuge Tubes | LABSELECT | CT-002-15 | Lab consumable. |
| 24 well cell culture plate | Falcon | 351147 | Neutrophil culture plate. |
| 50 mL Centrifuge Tubes | LABSELECT | CT-002-50 | Lab consumable. |
| BD LSRII | BD | Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death. | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | C4901 | Assitant of Annexin-V binding to phosphatidylserine. |
| Confocal microscope | Perkinelmer | UltraVIEW VOX | Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death. |
| Confocal plate | NEST | 801001-20mm | Lab consumable for fluorescent image assay. |
| Counting beads | Thermo Fisher | C36950 | Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death. |
| DFO | Sigma Aldrich | D9533 | Component of CLON-G. LMP inhibitor. |
| Dimethyl sulfoxide ( DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099141C | Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply. |
| FITC-Annexin-V | BD | 51-65874X | Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel. |
| Hsp70 | Abcam | ab113187 | Component of CLON-G. LMP inhibitor. |
| NAC | Sigma Aldrich | A9165 | Component of CLON-G. Antioxidant. |
| Nec-1s | EMD Millipore | 852391-15-2 | Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor. |
| Penicillin-Streptomycin Solution (PS) | Gibco | 15070063 | Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination. |
| Propidium Iodide (PI) | BioLegend | 421301 | For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane. |
| Q-VD-oph | Selleck chem | S7311 | Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor. |
| Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF) | Chugai Pharma China | GRANOCYTE | Component of CLON-G. Promote neutrophil survival through Akt pathway. |
| Round-Bottom Polystyrene Tubes | Falcon | 100-0102 | Lab consumable for flow cytometry analysis. |
| RPMI1640 | Gibco | C11875500BT | Component of neutrophil culture basic medium. |
| Saline | LEAGENE | R00641 | Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death. |
| Sodium hydroxide (NaOH) | FENG CHUAN | 13-011-00029 | pH adjustion for NAC. |
| Wright-Giemsa Stain Solution | Solarbio | G1020 | Neutrophil cytospin staining. |
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