Nøytrofil levetidsforlengelse med CLON-G og en in vitro spontan dødsanalyse

Summary

Denne protokollen beskriver fremstillingen av CLON-G for å forlenge den nøytrofile levetiden til mer enn 5 dager og gir en pålitelig prosedyre for evaluering av nøytrofil død med flowcytometri og konfokal fluorescensmikroskopi.

Abstract

Den gjennomsnittlige levetiden til en nøytrofil er mindre enn 24 timer, noe som begrenser grunnleggende forskning på nøytrofiler og anvendelse av nøytrofile studier. Vår tidligere forskning indikerte at flere veier kunne formidle spontan død av nøytrofiler. En cocktail ble utviklet ved samtidig å målrette disse veiene, kaspaser-lysosomale membranpermeabilisering-oksidant-nekroptoseinhibering pluss granulocytkolonistimulerende faktor (CLON-G), som forlenget den nøytrofile levetiden til mer enn 5 dager uten signifikant å kompromittere den nøytrofile funksjonen. Samtidig ble det også utviklet en pålitelig og stabil protokoll for vurdering og evaluering av nøytrofil død. I dette arbeidet viser vi at CLON-G kan forlenge den nøytrofile levetiden in vitro til mer enn 5 dager, og vi viser forlengelsen av den nøytrofile levetiden med FACS og konfokal fluorescensmikroskopi. Denne rapporten introduserer prosedyrer for fremstilling av CLON-G og viser en in vitro spontan dødsanalyse av nøytrofiler, som kan brukes til studier av nøytrofiler og for senere å undersøke nøytrofil død, og dermed gi en pålitelig ressurs for det nøytrofile samfunnet.

Introduction

Nøytrofiler er kjent for å omfatte et arsenal av rikelig cytoplasmatiske granulater, nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat (NADPH) oksidase, antimikrobielle enzymer og forskjellige organeller som forsvarer seg mot invaderende mikrober; I tillegg er de svært bevegelige og er de første cellene som rekrutteres til betennelsesstedet, noe som betyr at nøytrofiler er den første forsvarslinjen til det medfødte immunsystemet ^1,2. Granulocyttransfusjonsbehandling har dermed blitt en lovende klinisk behandling for nøytropenirelaterte infeksjoner for forbigående å øke nøytrofil immunitet ^3,4,5. Nylige funn har tydelig vist at nøytrofiler også fungerer som mangefasetterte effektorer i mange fysiopatologiske scenarier⁶. Den gjennomsnittlige levetiden til en nøytrofil er mindre enn 24 timer, og dermed er grunnleggende forskning på nøytrofiler og anvendelse av nøytrofile studier enormt vanskelig på grunn av begrensningene knyttet til stabil genetisk manipulasjon og langsiktig lagring 7,8,9,10,11 . Det er noen cellelinjer som delvis kan vise frem noen nøytrofile funksjoner, som HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 og induserte pluripotente stamceller¹². Disse cellelinjene kan oppnå effektiv genredigering og kryopreservering; Imidlertid er de fortsatt ganske forskjellige ganske enormt fra primære nøytrofiler og kan derfor ikke trofast rekapitulere nøytrofile funksjoner¹³. Dermed er det meste av forskningen på dette feltet fortsatt avhengig av ferskt isolerte primære nøytrofiler. Feltet er fortsatt avhengig av å generere dyre og tidkrevende betingede knock-out mus for å undersøke spesifikke genfunksjoner i nøytrofiler, men ingen menneskelige modeller eksisterer for øyeblikket.

Etter å ha lagt vår innsats i å utforske de heterogene prosessene som er involvert i nøytrofil død og de mange veiene som regulerer disse prosessene^14,15, ble det nylig rapportert en ny behandling kalt CLON-G (caspases-lysosomal membranpermeabilization-oxidant-necroptosis inhibition plus granulocyte colony-stimulating factor) ¹⁶. CLON-G består av Q-VD-oph (kinolyl-valyl-O-metylaspartyl-[-2,6-difluorfenoksy]-metylketon), Hsp70 (varmesjokkprotein 70), DFO (deferoksamin), NAC (N-acetylcystein), Nec-1s (nekrostatin-1s) og G-CSF (granulocyttkolonistimulerende faktor). Nøytrofil spontan død er mediert av flere veier, inkludert apoptose, nekroptose og pyroptose. Q-VD-oph hemmer apoptosen av nøytrofiler som en pan-caspase-hemmer ved å målrette caspase 1, caspase 3, caspase 8 og caspase 9¹⁷. Nøytrofil nekroptose er avhengig av en signalvei som involverer reseptorinteragerende proteinkinase-1 (RIPK1) og blandet avstamning kinase domenelignende protein (MLKL)¹⁸. Som en RIPK1-hemmer Nec-1s nekriptosen av nøytrofiler. Hsp70 og DFO kan hemme lysosomal membranpermeabilisering (LMP), som kan indusere nøytrofil apoptose¹⁹ og pyroptose²⁰. Reaktive oksygenarter (ROS) spiller viktige roller i nøytrofil død ved å formidle LMP¹⁹ og apoptose²¹ og ved å hemme overlevelsessignaler²². Som en antioksidant som kan redusere ROS-akkumulering, forsinker NAC nøytrofil død. Som vekstfaktor aktiverer G-CSF nøytrofile overlevelsessignaler og hemmer kalpainindusert apoptose^23,24. Ved samtidig å målrette mot flere nøytrofile spontane dødsveier, kan den nøytrofile levetiden effektivt forlenges til mer enn 5 dager uten at det går ut over funksjonen. CLON-G-behandling utvider mulighetene for nøytrofil bevaring, transport og genmanipulasjon, noe som kan akselerere forskning i nøytrofilsamfunnet. I mellomtiden, basert på kunnskapen om nøytrofil død, kan de for tiden godkjente protokollene for celledødsanalyser forårsake uventet skade på nøytrofiler¹⁴, så disse protokollene har blitt raffinert for å være mer hensiktsmessige for nøytrofile studier. Denne rapporten gir detaljerte protokoller for nøytrofildyrking med CLON-G og en in vitro celledødsanalyse av nøytrofile museer ved bruk av flowcytometri og fluorescensavbildning. CLON-G er effektiv på både mus og humane nøytrofiler; Imidlertid er museprøvene demonstrert her for å forenkle denne protokollen. Konsentrasjonen av NAC er 1 mM for nøytrofiler fra mus og 10 μM for humane nøytrofiler. Hsp70 er artsspesifikk og bør derfor utnyttes i henhold til kilden til nøytrofilen. For denne protokollen spiller det ingen rolle om nøytrofiler er isolert fra perifert blod eller benmarg og hvordan de er isolert.

For denne studien ble nøytrofiler isolert fra musebenmarg for å oppnå nok nøytrofiler til forsøkene, da ca. 1 x 10 7-1,5 x 10⁷ nøytrofiler kan fås fra benmargen, mens bare 1 x 10 6 nøytrofiler kan isoleres fra perifert blod av en enkelt 8-12 uker gammel C57BL /⁶ mus (av begge kjønn). Gradient sentrifugering ble utført for å unngå mulig skade og aktivering fra mekanisk stimulering av FACS sortering eller MACS sortering.

Protocol

Boston Children’s Hospital og State Key Laboratory of Experimental Hematology (SKLEH) Animal Care and Use Committee godkjente og overvåket alle prosedyrene. Figur 1 viser flytskjema for dyrkning av nøytrofile granulocytter med CLON-G og in vitro dødsanalyse. 1. Forlengelse av nøytrofil levetid med CLON-G MERK: Alle nevnte operasjoner og materialer må være sterile. Sørg for at alle løsningene er godt bland…

Representative Results

Wright-Giemsa-farget morfologi (figur 2A-D) og FACS-fenotyper (figur 2E-J) av CLON-G-behandlede nøytrofiler ble ikke påvirket. Levedyktigheten til de CLON-G-behandlede nøytrofile ved 24 timer var ca. 90 %+ basert på flowcytometrianalyse (figur 3) og fluorescerende bildeanalyser (figur 4). Lavere levedyktighet kan skyldes feil lagrin…

Discussion

Neutrofiler spiller viktige roller i medfødt og adaptiv immunitet, og deres homeostase er tett regulert. Neutrofiler er de mest tallrike leukocytter i humant perifert blod, og de har en robust og rask omsetning. En frisk voksen kan frigjøre 1 x 10⁹ nøytrofiler/kg daglig fra benmargen²⁸. Døden av nøytrofiler har dermed blitt en av de forvirrende gåtene i dette feltet, og mye innsats har blitt viet til å bedre forstå dem. Kaspase 29,30,31,32, LMP 33, ROS^21,22,33<…

Materials

0.2 µm syringe filter	Pall Corporation	4612	Filtrate prepared CLON-G components.
1.5 mL micro centrifuge tube	LABSELECT	MCT-001-150	Lab consumable.
15 mL Centrifuge Tubes	LABSELECT	CT-002-15	Lab consumable.
24 well cell culture plate	Falcon	351147	Neutrophil culture plate.
50 mL Centrifuge Tubes	LABSELECT	CT-002-50	Lab consumable.
BD LSRII	BD		Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	C4901	Assitant of Annexin-V binding  to phosphatidylserine.
Confocal microscope	Perkinelmer	UltraVIEW VOX	Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death.
Confocal plate	NEST	801001-20mm	Lab consumable for fluorescent image assay.
Counting beads	Thermo Fisher	C36950	Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death.
DFO	Sigma Aldrich	D9533	Component of CLON-G. LMP inhibitor.
Dimethyl sulfoxide ( DMSO)	Sigma Aldrich	D2650	Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s.
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099141C	Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply.
FITC-Annexin-V	BD	51-65874X	Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel.
Hsp70	Abcam	ab113187	Component of CLON-G. LMP inhibitor.
NAC	Sigma Aldrich	A9165	Component of CLON-G. Antioxidant.
Nec-1s	EMD Millipore	852391-15-2	Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor.
Penicillin-Streptomycin Solution (PS)	Gibco	15070063	Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination.
Propidium Iodide (PI)	BioLegend	421301	For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA  but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane.
Q-VD-oph	Selleck chem	S7311	Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor.
Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF)	Chugai Pharma China	GRANOCYTE	Component of CLON-G.  Promote neutrophil survival through Akt pathway.
Round-Bottom Polystyrene Tubes	Falcon	100-0102	Lab consumable for flow cytometry analysis.
RPMI1640	Gibco	C11875500BT	Component of neutrophil culture basic medium.
Saline	LEAGENE	R00641	Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Sodium hydroxide (NaOH)	FENG CHUAN	13-011-00029	pH adjustion for NAC.
Wright-Giemsa Stain Solution	Solarbio	G1020	Neutrophil cytospin staining.