JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

CLON-G ile Nötrofil Yaşam Süresinin Uzatılması ve In Vitro Spontan Ölüm Testi

Published: May 12, 2023
doi:
10.3791/65132
, , , , , ,
1State Key Laboratory of Experimental Hematology, National Clinical Research Center for Blood Diseases, Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, Institute of Hematology & Blood Diseases Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2Tianjin Institutes of Health Science, 3Sichuan Provincial People’s Hospital,University of Electronic Science and Technology of China, 4Haihe Laboratory of Cell Ecosystem,Tianjin Medical University, 5Joint Program in Transfusion Medicine, Department of Pathology, Harvard Medical School; Division of Blood Bank, Department of Laboratory Medicine, The Stem Cell Program, Boston Children’s Hospital,Dana-Farber /Harvard Cancer Center

Summary

Bu protokol, nötrofil ömrünü 5 günden fazla uzatmak için CLON-G’nin hazırlanmasını detaylandırır ve akış sitometrisi ve konfokal floresan mikroskobu ile nötrofil ölümünü değerlendirmek için güvenilir bir prosedür sağlar.

Abstract

Bir nötrofilin ortalama ömrü 24 saatten azdır, bu da nötrofiller hakkındaki temel araştırmaları ve nötrofil çalışmalarının uygulanmasını sınırlar. Önceki araştırmamız, çoklu yolakların nötrofillerin kendiliğinden ölümüne aracılık edebileceğini göstermiştir. Bu yolakları, kaspaz-lizozomal membran geçirgenliğini-oksidan-nekroptoz inhibisyonunu ve granülosit koloni uyarıcı faktörü (CLON-G) eş zamanlı olarak hedefleyerek, nötrofil fonksiyonunu önemli ölçüde tehlikeye atmadan nötrofil ömrünü 5 günden fazla uzatan bir kokteyl geliştirilmiştir. Aynı zamanda, nötrofil ölümünü değerlendirmek ve değerlendirmek için güvenilir ve istikrarlı bir protokol de geliştirilmiştir. Bu çalışmada CLON-G’nin nötrofil ömrünü in vitro olarak 5 günden fazla uzatabildiğini göstermiş, FACS ve konfokal floresan mikroskobu ile nötrofil ömrünün uzamasını sergilemiş bulunmaktayız. Bu rapor, CLON-G’nin hazırlanması için prosedürleri tanıtmakta ve nötrofillerin incelenmesi ve daha sonra nötrofil ölümünün sorgulanması için kullanılabilecek nötrofillerin in vitro spontan ölüm testini sergilemektedir, böylece nötrofil topluluğu için güvenilir bir kaynak sağlamaktadır.

Introduction

Nötrofillerin bol miktarda sitoplazmik granül, nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADPH) oksidaz, antimikrobiyal enzimler ve istilacı mikroplara karşı savunma yapan çeşitli organellerden oluşan bir cephanelik içerdiği bilinmektedir; Ek olarak, oldukça hareketlidirler ve iltihaplanma bölgesine alınan ilk hücrelerdir, yani nötrofiller doğuştan gelen bağışıklık sisteminin ilk savunma hattıdır 1,2. Bu nedenle granülosit transfüzyon tedavisi, nötropeniye bağlı enfeksiyonlar için nötrofil bağışıklığını geçici olarak artırmak için umut verici bir klinik tedavi haline gelmiştir 3,4,5. Son keşifler, nötrofillerin birçok fizyopatolojik senaryoda çok yüzlü efektörler olarak da işlev gördüğünü açıkça göstermiştir6. Bir nötrofilin ortalama ömrü 24 saatten azdır ve bu nedenle, nötrofiller üzerine temel araştırmalar ve nötrofil çalışmalarının uygulanması, kararlı genetik manipülasyon ve uzun süreli depolama ile ilgili sınırlamalar nedeniyle son derece zordur 7,8,9,10,11 . HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler12 gibi bazı nötrofil fonksiyonlarını kısmen sergileyebilen bazı hücre hatları vardır. Bu hücre hatları etkili gen düzenleme ve kriyoprezervasyon sağlayabilir; Bununla birlikte, birincil nötrofillerden hala oldukça farklıdırlar ve bu nedenle nötrofil fonksiyonlarını sadık bir şekilde özetleyemezler13. Bu nedenle, bu alandaki araştırmaların çoğu hala taze izole edilmiş birincil nötrofillere dayanmaktadır. Alan hala nötrofillerdeki spesifik gen fonksiyonlarını araştırmak için pahalı ve zaman alıcı koşullu nakavt fareleri üretmeye dayanıyor, ancak şu anda hiçbir insan modeli mevcut değil.

Nötrofil ölümünde yer alan heterojen süreçleri ve bu süreçleri düzenleyen çoklu yolları keşfetmeye yönelik çabalarımızı ortaya koyduktan sonra,14,15, CLON-G (kaspazlar-lizozomal membran geçirgenliği-oksidan-nekroptoz inhibisyonu artı granülosit koloni uyarıcı faktör) olarak adlandırılan yeni bir tedavi yakın zamanda bildirilmiştir 16. KLON-G, Q-VD-oph (kinolil-valil-O-metilaspartyl-[-2,6-diflorofenoksi]-metil keton), Hsp70 (ısı şoku proteini 70), DFO (deferoksamin), NAC (N-asetilsistein), Nec-1’ler (nekrostatin-1’ler) ve G-CSF’den (granülosit koloni uyarıcı faktör) oluşur. Nötrofil spontan ölümüne, apoptoz, nekroptoz ve piroptoz dahil olmak üzere birçok yol aracılık eder. Q-VD-oph, kaspaz 1, kaspaz 3, kaspaz 8 ve kaspaz 917’yi hedef alarak nötrofillerin pan-kaspaz inhibitörü olarak apoptozunu inhibe eder. Nötrofil nekroptozu, reseptörle etkileşime giren protein kinaz-1 (RIPK1) ve karışık soy kinaz etki alanı benzeri proteini (MLKL)18 içeren bir sinyal yoluna bağlıdır. Bir RIPK1 inhibitörü olarak, Nec-1’ler nötrofillerin nekrotozunu inhibe eder. Hsp70 ve DFO, nötrofil apoptozu19 ve piroptoz20’yi indükleyebilen lizozomal membran geçirgenliğini (LMP) inhibe edebilir. Reaktif oksijen türleri (ROS), LMP19 ve apoptoz21’e aracılık ederek ve sağkalım sinyallerini22’yi inhibe ederek nötrofil ölümünde hayati rol oynamaktadır. ROS birikimini azaltabilen bir antioksidan olarak NAC, nötrofil ölümünü geciktirir. Bir büyüme faktörü olarak, G-CSF nötrofil sağkalım sinyallerini aktive eder ve calpain kaynaklı apoptozu inhibe eder23,24. Aynı anda birden fazla nötrofil spontan ölüm yolunu hedefleyerek, nötrofil ömrü, işlevlerinden ödün vermeden etkili bir şekilde 5 günden fazla uzatılabilir. CLON-G tedavisi, nötrofil topluluğundaki araştırmaları hızlandırabilecek nötrofil koruma, taşıma ve gen manipülasyonu olanaklarını genişletir. Bu arada, nötrofil ölümü bilgisine dayanarak, hücre ölümü testleri için şu anda onaylanmış protokoller nötrofillerde beklenmedik hasara neden olabilir14, bu nedenle bu protokoller nötrofil çalışmaları için daha uygun olacak şekilde rafine edilmiştir. Bu rapor, CLON-G ile nötrofil kültürlemesi için ayrıntılı protokoller ve akış sitometrisi ve floresan görüntüleme kullanılarak fare nötrofillerinin in vitro hücre ölüm testini sunmaktadır. CLON-G hem fare hem de insan nötrofilleri üzerinde etkilidir; ancak, bu protokolü basitleştirmek için fare örnekleri burada gösterilmiştir. NAC konsantrasyonu, fare nötrofilleri için 1 mM ve insan nötrofilleri için 10 μM’dir. Hsp70 türe özgüdür ve bu nedenle nötrofilin kaynağına göre kullanılmalıdır. Bu protokol için, nötrofillerin periferik kandan mı yoksa kemik iliğinden mi izole edildiği ve nasıl izole edildiği önemli değildir.

Bu çalışma için, deneyler için yeterli nötrofil elde etmek için fare kemik iliğinden nötrofiller izole edilmiştir, çünkü kemik iliğinden yaklaşık 1 x 10 7-1.5 x 107 nötrofil elde edilebilirken, tek bir 8-12 haftalık C57BL / 6 faresinin (her iki cinsiyetten) periferik kanından sadece 1 x 106 nötrofil izole edilebilir. Gradyan santrifüjlemesi, FACS ayıklama veya MACS sıralamanın mekanik uyarımından kaynaklanan olası hasarı ve aktivasyonu önlemek için gerçekleştirilmiştir.

Protocol

Boston Çocuk Hastanesi ve Deneysel Hematoloji Eyalet Anahtar Laboratuvarı (SKLEH) Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tüm prosedürleri onayladı ve izledi. Şekil 1 , CLON-G ve in vitro ölüm testi ile nötrofil kültürlenmesinin bir akış şemasını göstermektedir. 1. CLON-G ile nötrofil ömrünün uzatılması NOT: Belirtilen tüm işlemler ve malzemeler steril olmalıdır. Tüm çözeltilerin iyi…

Representative Results

CLON-G ile tedavi edilen nötrofillerin Wright-Giemsa boyalı morfolojisi (Şekil 2A-D) ve FACS fenotipleri (Şekil 2E-J) etkilenmedi. CLON-G ile tedavi edilen nötrofillerin 24 saatte yaşayabilirliği, akış sitometri analizine (Şekil 3) ve floresan görüntü analizlerine (Şekil 4) dayanarak yaklaşık% 90 + idi. Daha düşük can…

Discussion

Nötrofiller doğuştan gelen ve adaptif bağışıklıkta hayati roller oynar ve homeostazları sıkı bir şekilde düzenlenir. Nötrofiller, insan periferik kanındaki en bol lökositlerdir ve sağlam ve hızlı bir ciroya sahiptirler. Sağlıklı bir yetişkin, kemik iliğinden günde 1 x 109 nötrofil / kg salgılayabilir28. Nötrofillerin ölümü bu nedenle bu alanın şaşırtıcı gizemlerinden biri haline geldi ve onları daha iyi anlamak için çok çaba sarf edildi. Kaspaz 2…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu proje, Haihe Hücre Ekosistemi İnovasyon Fonu Laboratuvarı (22HHXBSS00036, 22HHXBSS00019), Çin Tıp Bilimleri Akademisi (CAMS) Tıp Bilimleri İnovasyon Fonu (2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015), Merkez Üniversiteler Özel Araştırma Fonu, Pekin Birliği Tıp Koleji (3332022062) ve Sichuan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Destek Programı (NO. 2021YJ0480) tarafından desteklenmiştir.

Materials

0.2 µm syringe filter Pall Corporation 4612 Filtrate prepared CLON-G components.
1.5 mL micro centrifuge tube LABSELECT MCT-001-150 Lab consumable.
15 mL Centrifuge Tubes LABSELECT CT-002-15 Lab consumable.
24 well cell culture plate Falcon 351147 Neutrophil culture plate.
50 mL Centrifuge Tubes LABSELECT CT-002-50 Lab consumable.
BD LSRII BD Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Calcium chloride (CaCl2) Sigma Aldrich C4901 Assitant of Annexin-V binding  to phosphatidylserine.
Confocal microscope Perkinelmer UltraVIEW VOX Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death.
Confocal plate NEST 801001-20mm Lab consumable for fluorescent image assay.
Counting beads Thermo Fisher C36950 Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death.
DFO Sigma Aldrich D9533 Component of CLON-G. LMP inhibitor.
Dimethyl sulfoxide ( DMSO) Sigma Aldrich D2650 Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s.
Fetal Bovine Serum Gibco 10099141C Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply.
FITC-Annexin-V BD 51-65874X Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel.
Hsp70 Abcam ab113187 Component of CLON-G. LMP inhibitor.
NAC Sigma Aldrich A9165 Component of CLON-G. Antioxidant.
Nec-1s EMD Millipore 852391-15-2 Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor.
Penicillin-Streptomycin Solution (PS) Gibco 15070063 Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination.
Propidium Iodide (PI) BioLegend 421301 For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA  but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane.
Q-VD-oph Selleck chem S7311 Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor.
Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF) Chugai Pharma China GRANOCYTE Component of CLON-G.  Promote neutrophil survival through Akt pathway.
Round-Bottom Polystyrene Tubes Falcon 100-0102 Lab consumable for flow cytometry analysis.
RPMI1640 Gibco C11875500BT Component of neutrophil culture basic medium.
Saline LEAGENE R00641 Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Sodium hydroxide (NaOH) FENG CHUAN 13-011-00029 pH adjustion for NAC.
Wright-Giemsa Stain Solution Solarbio G1020 Neutrophil cytospin staining.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Segal, A. W. How neutrophils kill microbes. Annual Review of Immunology. 23, 197-223 (2005).
  2. Rosales, C. Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types. Frontiers in Physiology. 9, 113 (2018).
  3. Chung, S., Armstrong-Scott, O., Charlewood, R. Therapeutic granulocyte infusion for patients with severe neutropaenia and neutrophilic dysfunction: New Zealand experience. Vox Sanguinis. 117 (2), 220-226 (2021).
  4. Zhou, B., et al. Clinical outcome of granulocyte transfusion therapy for the treatment of refractory infection in neutropenic patients with hematological diseases. Annals of Hematology. 97 (11), 2061-2070 (2018).
  5. Covas, D. T., et al. Granulocyte transfusion combined with granulocyte colony stimulating factor in severe infection patients with severe aplastic anemia: A single center experience from China. PLoS One. 9 (2), e88148 (2014).
  6. Tecchio, C., Cassatella, M. A. Uncovering the multifaceted roles played by neutrophils in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 905-918 (2021).
  7. Lahoz-Beneytez, J., et al. Human neutrophil kinetics: Modeling of stable isotope labeling data supports short blood neutrophil half-lives. Blood. 127 (26), 3431-3438 (2016).
  8. Pillay, J., et al. In vivo labeling with 2H2O reveals a human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 116 (4), 625-627 (2010).
  9. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
  10. Tofts, P. S., Chevassut, T., Cutajar, M., Dowell, N. G., Peters, A. M. Doubts concerning the recently reported human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 117 (22), 6050-6052 (2011).
  11. McDonald, J. U., et al. In vivo functional analysis and genetic modification of in vitro-derived mouse neutrophils. FASEB Journal. 25 (6), 1972-1982 (2011).
  12. Pedruzzi, E., Fay, M., Elbim, C., Gaudry, M., Gougerot-Pocidalo, M. -. A. Differentiation of PLB-985 myeloid cells into mature neutrophils, shown by degranulation of terminally differentiated compartments in response to N-formyl peptide and priming of superoxide anion production by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. British Journal of Haematology. 117 (3), 719-726 (2002).
  13. Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: Cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
  14. Teng, Y., Luo, H. R., Kambara, H. Heterogeneity of neutrophil spontaneous death. American Journal of Hematology. 92 (8), E156-E159 (2017).
  15. Luo, H. R., Loison, F. Constitutive neutrophil apoptosis: Mechanisms and regulation. American Journal of Hematology. 83 (4), 288-295 (2008).
  16. Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
  17. Caserta, T. M. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis. 8, 345-352 (2003).
  18. Wang, X., Yousefi, S., Simon, H. U. Necroptosis and neutrophil-associated disorders. Cell Death and Disorders. 9 (2), 111 (2018).
  19. Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
  20. Kambara, H., et al. Gasdermin D exerts anti-inflammatory effects by promoting neutrophil death. Cell Reports. 22 (11), 2924-2936 (2018).
  21. Zhu, D., et al. Deactivation of phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate/Akt signaling mediates neutrophil spontaneous death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (40), 14836-14841 (2006).
  22. Xu, Y., Loison, F., Luo, H. R. Neutrophil spontaneous death is mediated by down-regulation of autocrine signaling through GPCR, PI3Kgamma, ROS, and actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 2950-2955 (2010).
  23. van Raam, B. J., Drewniak, A., Groenewold, V., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor delays neutrophil apoptosis by inhibition of calpains upstream of caspase-3. Blood. 112 (5), 2046-2054 (2008).
  24. Klein, J. B., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor delays neutrophil constitutive apoptosis through phosphoinositide 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase pathways. Journal of Immunology. 164 (8), 4286-4291 (2000).
  25. Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
  26. Xie, X., et al. Single-cell transcriptome profiling reveals neutrophil heterogeneity in homeostasis and infection. Nature Immunology. 21 (9), 1119-1133 (2020).
  27. Cosimo, E., et al. Inhibition of NF-kappaB-mediated signaling by the cyclin-dependent kinase inhibitor CR8 overcomes prosurvival stimuli to induce apoptosis in chronic lymphocytic leukemia cells. Clinical Cancer Research. 19 (9), 2393-2405 (2013).
  28. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
  29. Porter, A. G., Jänicke, R. U. Emerging roles of caspase-3 in apoptosis. Cell Death and Differentiation. 6 (2), 99-104 (1999).
  30. Scheel-Toellner, D., et al. Clustering of death receptors in lipid rafts initiates neutrophil spontaneous apoptosis. Biochemical Society Transactions. 32, 679-681 (2004).
  31. Geering, B., Simon, H. U. Peculiarities of cell death mechanisms in neutrophils. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1457-1469 (2011).
  32. Gabelloni, M. L., Trevani, A. S., Sabatté, J., Geffner, J. Mechanisms regulating neutrophil survival and cell death. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 423-437 (2013).
  33. Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
  34. Cho, Y. S., et al. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell. 137 (6), 1112-1123 (2009).
  35. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
  36. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
  37. Zhang, D. -. W., et al. RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis. Science. 325 (5938), 332-336 (2009).
  38. Wang, X., He, Z., Liu, H., Yousefi, S., Simon, H. -. U. Neutrophil necroptosis is triggered by ligation of adhesion molecules following GM-CSF priming. Journal of Immunology. 197 (10), 4090-4100 (2016).
  39. Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837 (2021).
  40. George, B., Bhattacharya, S., Chandy, M., Radhakrishnan, V. S., Sukumaran, R. Infections in hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) patients. Contemporary Bone Marrow Transplantation. , (2020).
  41. Lucena, C. M., et al. Pulmonary complications in hematopoietic SCT: A prospective study. Bone Marrow Transplant. 49 (10), 1293-1299 (2014).
  42. Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: A global perspective. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (10), 1143-1238 (2009).
  43. Wingard, J. R., Hiemenz, J. W., Jantz, M. A. How I manage pulmonary nodular lesions and nodular infiltrates in patients with hematologic malignancies or undergoing hematopoietic cell transplantation. Blood. 120 (9), 1791-1800 (2012).
  44. Wingard, J. R., Hsu, J., Hiemenz, J. W. Hematopoietic stem cell transplantation: An overview of infection risks and epidemiology. Infectious Disease Clinics of North America. 24 (2), 257-272 (2010).
  45. Netelenbos, T., et al. The burden of invasive infections in neutropenic patients: incidence, outcomes, and use of granulocyte transfusions. Transfusion. 59 (1), 160-168 (2019).

Tags

Neutrophil LifespanCLON-GIn Vitro Spontaneous Death AssayNeutrophil PreservationNeutrophil TransportationNeutrophil Gene ManipulationFlow CytometryFluorescent ImagingCell Culture

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Fan, Y., Teng, Y., Liu, F. t., Ma, F., Hsu, A. Y., Feng, S., Luo, H. R. Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay. J. Vis. Exp. (195), e65132, doi:10.3791/65132 (2023).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image