يفصل هذا البروتوكول إثراء الحويصلات خارج الخلية المتفطرة الأصلية (mEVs) من الثقافات المحورية للمتفطرة smegmatis (Msm) وكيف يمكن تصميم وإثراء mCherry (مراسل الفلورسنت الأحمر) المحتوي على MSMEVs المؤتلفة. أخيرا ، يتحقق من النهج الجديد مع إثراء MsmEVs التي تحتوي على بروتين EsxA من المتفطرة السلية.
معظم البكتيريا ، بما في ذلك المتفطرات ، تولد حويصلات خارج الخلية (EVs). نظرا لأن EVs البكتيرية (bEVs) تحتوي على مجموعة فرعية من المكونات الخلوية ، بما في ذلك المستقلبات والدهون والبروتينات والأحماض النووية ، فقد قامت عدة مجموعات بتقييم الإصدارات الأصلية أو المؤتلفة من bEVs لقوتها الوقائية كمرشحين للقاح الوحدة الفرعية. على عكس المركبات الكهربائية الأصلية ، يتم تصميم المركبات الكهربائية المؤتلفة جزيئيا لتحتوي على واحد أو أكثر من مناعيات الاهتمام. على مدى العقد الماضي ، استكشفت مجموعات مختلفة مناهج متنوعة لتوليد المركبات الكهربائية المؤتلفة. ومع ذلك ، هنا ، نبلغ عن تصميم وبناء وإثراء المركبات الكهربائية المتفطرة المؤتلفة (mEVs) في المتفطرات. نحو ذلك ، نستخدم المتفطرة smegmatis (MSM) ، وهي متفطرة التربة الطيرية كنظام نموذجي. نصف أولا توليد وإثراء المركبات الكهربائية الأصلية ل MSM. بعد ذلك ، نصف تصميم وبناء mEVs المؤتلف التي تحتوي إما على mCherry ، وهو بروتين مراسل فلوري أحمر ، أو EsxA (Esat-6) ، وهو مناعي بارز للمتفطرة السلية. نحقق ذلك عن طريق دمج mCherry و EsxA N-termini بشكل منفصل مع الطرف C لبروتين MSM صغير Cfp-29. Cfp-29 هو واحد من البروتينات القليلة الموجودة بكثرة من MsmEVs. يظل بروتوكول توليد وإثراء المركبات الكهربائية المؤتلفة من MSM مطابقا لتوليد وإثراء المركبات الكهربائية الأصلية من MSM.
على الرغم من تطوير وإدارة مجموعة واسعة من اللقاحات ضد الأمراض المعدية ، حتى يومنا هذا ، ~ 30 ٪ من جميع الوفيات البشرية لا تزال تحدث من الأمراض المعدية1. قبل ظهور لقاح السل (TB) – Bacillus Calmette Guerin (BCG) – كان السل هو القاتل الأول (~ 10000 إلى 15000 / 100000 نسمة) 2. مع إعطاء BCG وسهولة الوصول إلى أدوية الخط الأول والثاني المضادة للسل ، بحلول عام 2022 ، انخفضت الوفيات المرتبطة بالسل بشكل كبير إلى ~ 1 مليون / سنة بحلول عام 2022 (أي ~ 15-20 / 100000 نسمة1). ومع ذلك ، في السكان الموبوءين بالسل في العالم ، لا تزال الوفيات المرتبطة بالسل تقف عند ~ 100-550 / 100000 نسمة1. بينما يدرك الخبراء عدة أسباب تؤدي إلى هذه الأرقام المنحرفة ، يبدو أن الحماية بوساطة BCG التي لا تدوم حتى في العقد الأول من العمر هي السبب البارز3،4،5،6،7. ونتيجة لذلك، وبالنظر إلى “أهداف التنمية المستدامة” المتجددة للأمم المتحدة و”استراتيجية القضاء على السل” لمنظمة الصحة العالمية، هناك جهد عالمي متضافر لتطوير بديل لقاح أفضل بكثير من لقاح بوسطن كونسلتينج جروب الذي ربما يوفر حماية مدى الحياة من السل.
ولتحقيق هذا الهدف، تقوم عدة مجموعات حاليا بتقييم سلالات BCG المعدلة/المؤتلفة، والأنواع الفطرية غير المسببة للأمراض والموهنة بخلاف BCG، والوحدات الفرعية المرشحة8،9،10،11،12،13،14،15،16،17،18. عادة ما تكون لقاحات الوحدات الفرعية عبارة عن جسيمات شحمية محملة بشكل انتقائي بعدد قليل من البروتينات المناعية النقية (~ 1-6) كاملة الطول أو مبتورة من العامل الممرض. ومع ذلك ، بسبب طيها الزائف إلى توافقات غير أصلية و / أو تفاعلات عشوائية غير وظيفية بين البروتينات المحملة ، غالبا ما تفتقر الوحدات الفرعية إلى الحلقات الأصلية والوثيقة ، وبالتالي تفشل في تجهيز جهاز المناعة بشكل كاف14،19،20.
وبالتالي ، اكتسبت الحويصلات خارج الخلية (EVs) للبكتيريا وتيرة كبديل واعد21،22،23،24،25،26. عادة ، تحتوي EVs البكتيرية (bEVs) على مجموعة فرعية من مكوناتها الخلوية ، بما في ذلك بعض أجزاء الأحماض النووية والدهون ومئات المستقلبات والبروتينات27,28. على عكس الجسيمات الشحمية حيث يتم تحميل عدد قليل من البروتينات النقية بشكل مصطنع ، تحتوي bEVs على مئات البروتينات المحملة بشكل طبيعي والمطوية محليا مع ميل أفضل لتجهيز جهاز المناعة ، خاصة بدون تعزيز / مساعدة المواد المساعدة ومستقبلات تشبه الرسوم (TLR)27،28،29. في هذا الخط من البحث ، استكشفنا نحن وآخرون فائدة المركبات الكهربائية المتفطرة كمعززات محتملة للوحدات الفرعية ل BCG30. على الرغم من المخاوف من أن المركبات الكهربائية تفتقر إلى أحمال مستضدات موحدة ، فقد نجحت المركبات الكهربائية من النيسرية السحائية الموهنة في حماية البشر من المكورات السحائية من المجموعة المصليةB 31,32.
من الناحية النظرية على الأقل ، فإن أفضل المركبات الكهربائية التي يمكن أن تعزز BCG بشكل جيد هي المركبات الكهربائية المخصبة من البكتيريا المسببة للأمراض. ومع ذلك ، فإن إثراء المركبات الكهربائية الناتجة عن المتفطرة المسببة للأمراض مكلف ويستغرق وقتا طويلا ومحفوفا بالمخاطر. بالإضافة إلى ذلك ، قد تكون المركبات الكهربائية الناتجة عن مسببات الأمراض أكثر ضراوة من الحماية. بالنظر إلى المخاطر المحتملة ، هنا ، نبلغ عن بروتوكول تم اختباره جيدا لتخصيب المركبات الكهربائية الناتجة عن MSM المزروعة محوريا ، وهي متفطرة طيرية الطيور.
ومع ذلك ، على الرغم من تشفير العديد من تقويم البروتين الممرض ، تفتقر المتفطرات الفيروسية إلى العديد من مستضدات اللقاح / حوامل البروتين المسببة للأمراض اللازمة لتجهيز الجهاز المناعي بشكل كاف نحو الحماية33. لذلك ، استكشفنا أيضا بناء وإثراء المركبات الكهربائية المؤتلفة من MSM من خلال الهندسة الجزيئية ، بحيث يجب أن يصل جزء كبير من أي بروتين ممرض مهم يتم التعبير عنه وترجمته في MSM ، إلى EVs. افترضنا أن واحدا أو أكثر من أفضل 10 بروتينات وفيرة من MSM EVs عند دمجها مع البروتين محل الاهتمام سيساعد في هذا النقل.
بينما بدأنا في توحيد إثراء المركبات الكهربائية المتفطرة (mEVs) في مختبرنا ، في عام 2011 ، أبلغ Prados-Rosales et al. لأول مرة عن تصور وإثراء mEVs في المختبر30. في وقت لاحق ، في عام 2014 ، نشرت نفس المجموعة نسخة معدلة من طريقة2011 34. في عام 2015 ، أبلغ Lee et al. أيضا عن طريقة موحدة بشكل مستقل لتخصيب mEV مرة أخرى من الثقافات المحورية للمتفطرات35. من خلال الجمع بين كلا البروتوكولين 34,35 ودمج بعض تعديلاتنا بعد التوحيد الشامل ، نصف هنا بروتوكولا يساعد بشكل روتيني على إثراء mEVs من الثقافات المحورية للبكتيرياالفطرية 36.
هنا ، نفصل بشكل خاص إثراء المركبات الكهربائية الخاصة ب MSM ، وهو امتداد للبروتوكولالمنشور 36 لإثراء المركبات الكهربائية المتفطرة بشكل عام. نحن أيضا بالتفصيل كيفية بناء mEVs المؤتلف (R-mEVs) التي تحتوي على بروتين mCherry (كمراسل فلوري أحمر) و EsxA (Esat-6) 37،38،39 وهو مناعي سائد ووحدة فرعية محتملة لقاح المتفطرة السلية. يظل بروتوكول إثراء R-mEVs مطابقا للبروتوكول الذي وصفناه لإثراء المركبات الكهربائية الأصلية من MSM.
نظرا لأن تطوير لقاح جديد للسل يتفوق على BCG ويمكن أن يحل محله لا يزال يمثل تحديا هائلا ، كبديل ، تسعى العديد من المجموعات إلى اكتشاف لقاحات السل الفرعية المختلفة التي يمكن أن تعزز فعالية BCG وتطيل مدة الحماية48,49. نظرا للاهتمام المتزايد بالمركبات الكهربائية الب…
The authors have nothing to disclose.
يشكر المؤلفون بصدق البروفيسور سارة م. فورتشن على تفضله بمشاركة أسهم M. smegmatis mc2155. كما أنهم يعترفون ب Servier Medical Art (smart.servier.com) لتوفير بعض العناصر الأساسية للشكل 1. إنهم يعترفون بصدق بدعم بقية أعضاء المختبر لتعديلات المرضى أثناء الاستخدام الطويل لهزازات الحاضنة وأجهزة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي الفائقة لتخصيب mEV. كما أنهم يعترفون بالسيد سورجيت ياداف ، مساعد المختبر ، للتأكد دائما من أن الأواني الزجاجية والمواد الاستهلاكية اللازمة كانت دائما متاحة وسهلة الاستخدام. أخيرا ، يعترفون بالفرق الإدارية والمشتريات والمالية في THSTI لدعمهم المستمر ومساعدتهم في التنفيذ السلس للمشروع.
A2 type Biosafety Cabinet | Thermo Fisher Scientific, USA | 1300 series | |
Bench top Centrifuge | Eppendorf, USA | 5810 R | |
BstB1, HindIII, HpaI | NEB, USA | NEB | |
Cell densitometer | GE Healthcare, USA | Ultraspec 10 | |
Citric Acid | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
Dibasic Potassium Phosphate | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
Double Distilled Water | Merck, USA | ~18.2 MW/cm @ 25 oC | |
Electroporation cuvettes | Bio-Rad, USA | 2 mm | |
Electroporator | Bio-Rad, USA | Electroporator | |
EsxA-specific Ab | Abcam, UK | Rabbit polyclonal | |
Ferric Ammonium Citrate | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
Floor model centrifuge | Thermo Fisher Scientific, USA | Sorvall RC6 plus | |
Glassware | Borosil, INDIA | 1 L Erlenmeyer flasks | |
Glycerol | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
HEPES and Sodium Chloride | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
Incubator shakers | Thermo Fisher Scientific, USA | MaxQ 6000 & 8000 | |
L-Asparagine | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
Luria Bertani Broth and Agar, Miller | Hi Media, INDIA | Hi Media | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
Magnetic stirrer | Tarsons, INDIA | Tarsons | |
mCherry-specific Ab | Abcam, UK | Rabbit monoclonal | |
Microwave | LG, INDIA | MC3286BLT | |
Middlebrook 7H9 Broth | BD, USA | Difco Middlebrook 7H9 Broth | |
Middlebrook ADC enrichment | BD, USA | BBL Middlebrook ADC enrichment | |
Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, USA | Spectronic 200 UV-Vis | |
NEB5a | NEB, USA | a derivative of DH5a | |
Optiprep (Iodixanol) | Merck, USA | Available as 60% stock solution (in water) | |
PCR purification kit | Hi Media, INDIA | Hi Media | |
pH Meter | Mettler Toledo, USA | Mettler Toledo | |
Plasmid DNA mini kit | Hi Media, INDIA | Hi Media | |
Plate incubator | Thermo Fisher Scientific, USA | New Series | |
Plasmid pMV261 | Addgene, USA * *The plasmid is no more available in this plasmid bank |
Shuttle vector | |
Proof-reading DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific, USA | Phusion DNA Plus Polymerase | |
Q5 Proof-reading DNA Polymerase | NEB, USA | NEB | |
Refrigerated circulating water bath | Thermo Fisher Scientific, USA | R20 | |
Middlebrock 7H11 Agar base | BD, USA | BBL Seven H11 Agar base | |
SOC broth | Hi Media, INDIA | Hi Media | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
T4 DNA Ligase | NEB, USA | NEB | |
Tween-80 | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter, USA | Optima L100K | |
Ultracentrifuge tubes – 14 mL | Beckman Coulter, USA | Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor | |
Ultracentrifuge tubes – 38 mL | Beckman Coulter, USA | Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor | |
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator | Thermo Fisher Scientific, USA | Sonicator – bench top model | |
0.22 µm Disposable filters | Thermo Fisher Scientific, USA | Nunc-Nalgene | |
30-kDa Centricon concentrators | Merck, USA | Amicon Ultra centrifugal filters – Millipore | |
3X FLAG antibody | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
400 mL Centrifuge bottles | Thermo Fisher Scientific, USA | Nunc-Nalgene | |
50 mL Centrifuge tubes | Corning, USA | Sterile, pre-packed | |
Bacteria | |||
Strain | |||
Escherichia coli | NEB, USA | NEB 5-alpha (a derivative of DH5α). | |
Msm expressing cfp29::mCherry | This study | MC2 155 | |
Msm expressing cfp29::esxA | This study | MC2 155 | |
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG | This study | MC2 155 | |
Mycobacterium smegmatis (Msm) | Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA | MC2 155 |