Cellbaserad elektrisk impedansplattform för att utvärdera Zika-virushämmare i realtid

Summary

Här demonstrerar vi användningen av cellbaserad elektrisk impedans (CEI) som en mycket enkel och okomplicerad metod för att studera Zika-virusinfektion och replikation i mänskliga celler i realtid. Dessutom är CEI-analysen användbar för utvärdering av antivirala föreningar.

Abstract

Cellbaserad elektrisk impedans (CEI) -teknik mäter förändringar i impedans orsakad av ett växande eller manipulerat vidhäftande cellmonolager på odlingsplattbrunnar inbäddade med elektroder. Tekniken kan användas för att övervaka konsekvenserna av zikavirusinfektion (ZIKV) och vidhäftande cellreplikation i realtid, eftersom detta virus är mycket cytopatogent. Det är en enkel analys som inte kräver användning av etiketter eller invasiva metoder och har fördelen att tillhandahålla realtidsdata. Kinetiken för ZIKV-infektion är starkt beroende av den använda cellinjen, virusstammen och infektionsmultipliciteten (MOI), som inte lätt kan studeras med konventionella slutpunktsanalyser. Dessutom kan CEI-analysen också användas för utvärdering och karakterisering av antivirala föreningar, som också kan ha dynamiska hämmande egenskaper under infektionen. Denna metodartikel ger en detaljerad förklaring av det praktiska genomförandet av CEI-analysen och dess potentiella tillämpningar inom ZIKV-forskning och antiviral forskning i allmänhet.

Introduction

Zikavirus (ZIKV) utbrott är förknippade med allvarliga sjukdomskomplikationer, såsom mikrocefali och Guillain-Barrés syndrom ^1,2,3. Även om framtida epidemier är troliga på grund av olika riskfaktorer som spridning av myggvektordistribution och ökad urbanisering, har hittills inget vaccin eller antiviralt läkemedel kommit ut på marknaden ännu ^3,4. Därför bör traditionella ZIKV-forskningsmetoder kompletteras med nya verktyg för att studera detta virus och dess potentiella antivirala föreningar. Antiviral forskning baseras ofta på fenotypiska analyser, där slutpunkten är närvaron av en specifik parameter, såsom uppkomsten av en virusinducerad cytopatisk effekt (CPE) eller produktion av ett visst virusinducerat protein med hjälp av en reportergen ^5,6,7. Dessa metoder har dock slutpunktsavläsningar, är arbetsintensiva och kan kräva komplex analys. Därför erbjuder impedansbaserade metoder ett attraktivt alternativ.

Cellbaserad elektrisk impedans (CEI) definieras som motståndet mot strömflödet från en elektrod till en annan, orsakad av ett vidhäftande cellskikt sådd på elektrodinnehållande brunnar. Den etablerade CEI-tekniken som används i denna metod är Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS), ursprungligen utvecklad av Giaever och Keese ^8,9. Detta används inom ett brett fält av biologiska forskningsområden, såsom cancermetastaser, toxikologi och sårläkning^10,11,12. Dess princip bygger på ett elektriskt fält som genereras av en kontinuerlig svepning av växelström (AC) spänningar över ett frekvensområde¹³. Cellerna utsätts för dessa icke-invasiva elektriska fält, och med förutbestämda intervall mäts impedansförändringarna orsakade av celltillväxt eller förändringar i cellvidhäftning eller morfologi¹⁴. Dessutom leder förändrad cellviabilitet också till impedansförändringar, vilket gör tekniken till ett användbart verktyg för att övervaka infektion med cytopatogena virus^15,16,17. Eftersom morfologiska förändringar i cellskiktet kommer att detekteras i nanoskala erbjuder tekniken ett mycket känsligt detektionsverktyg. CEI-analysen som beskrivs i denna artikel är en enkel, icke-invasiv, etikettfri metod i realtid för att mäta impedansförändringarna i cellskiktet över tiden.

Även om CEI inte har använts för att utvärdera förloppet av ZIKV-infektion eller dess potentiella antivirala medel, har dess användning som ett diagnostiskt verktyg undersökts före¹⁸. I en nyligen genomförd studie validerades användningen av CEI-analysen för att bestämma den antivirala aktiviteten hos flera ZIKV-hämmare i A549-celler för första gången¹⁹. Denna metodartikel beskriver denna CEI-analys mer detaljerat och expanderar den till olika vidhäftande cellinjer, liksom en mängd olika ZIKV-stammar vid olika infektionsmultipliciteter (MOI). Härmed demonstreras den mångsidiga användningen av denna metod i flavivirus antiviral forskning. Metoden har den avgörande fördelen av cellövervakning i realtid, vilket möjliggör detektering av viktiga infektionstidpunkter och den dynamiska hämmande aktiviteten av potentiella antivirala föreningar. Sammantaget erbjuder CEI-tekniken ett kraftfullt och värdefullt verktyg för att komplettera det nuvarande utbudet av antivirala metoder.

Protocol

Alla beskrivna steg utförs under sterila förhållanden i ett laminärt flödesskåp i ett biosäkerhetsnivå 2-laboratorium. Alla använda virus erhölls och användes som godkända, enligt reglerna för en belgisk institutionell granskningsnämnd (Departement Leefmilieu, Natuur en Energie, protokoll SBB 219 2011/0011) och biosäkerhetskommittén vid KU Leuven. 1. Underhåll av cellodling OBS: Detta protokoll utförs med ett urval av cellinjer, men kan naturligtvis anpassas till vilken vidhäftande cellinje som helst, vilket endast kräver optimering av cellsådddensiteten. Odla A549 human lungadenokarcinom cellinje, U87 humant malignt glioblastom cellinje och HEL 299 humana embryonala lungfibroblastceller i T75 odlingskolvar vid 37 ° C och 5% CO2 i en fuktad inkubator. Subkultur cellerna vid 80% -95% sammanflöde. Alla reagens bör vara vid rumstemperatur (RT) innan cellerna odlas. Ta bort det konditionerade odlingsmediet från cellerna. Använd 5 ml Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) för att tvätta cellmonolagret en gång. Fördela 1 ml 0,25% trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) jämnt över cellmonoskiktet. Inkubera sedan i upp till 3 minuter vid 37 °C tills cellerna börjar lossna. Tillsätt 9 ml färskt komplett odlingsmedium (se Materialtabell för detaljer). Pipettera försiktigt upp och ner för att återsuspendera cellerna. Överför önskad volym cellsuspension till en ny T75-odlingskolv och tillsätt en lämplig volym färskt odlingsmedium så att en total volym på 15 ml erhålls.OBS: De in vitro-cellinjer som används i detta protokoll subkultiveras i spädningar från 1:4 till 1:10, beroende på den specifika cellinjen, för att möjliggöra idealiska tillväxtförhållanden. Subkulturer utförs var 3-4: e dag, så den önskade cellsuspensionsvolymen kan också variera beroende på antalet inkubationsdagar. 2. Beredning av CEI-plattan Ta en 96-brunnsplatta med interdigiterade elektroder (se materialtabell) och fyll alla brunnar med 100 μL tillväxtodlingsmedium. Fyll mellanrummen mellan brunnarna med DPBS.OBS: Detta görs för att minska kanteffekten på grund av avdunstning som observeras vid odling av celler i 96-brunnsplattor. Inkubera plattan i 4 timmar vid 37 °C i en inkubator med 5 %CO2. 3. Sådd av celler Lossa cellerna från odlingskolven enligt beskrivningen i avsnitt 1 och suspendera dem på nytt i ett 50 ml rör. Räkna antalet viabla celler med valfri metod.OBS: När det gäller A549-celler når livskraften i allmänhet ~ 100%. För att bestämma cellnumret använder vi ett automatiserat cellanalyssystem baserat på färgning av akridinapelsin/propidiumjodid (se Materialförteckning). Andra cellräkningsmetoder fungerar lika bra. Resuspendera cellerna i färskt tillväxtmedium för att erhålla önskad celldensitet. I denna studie är den optimala A549-celldensiteten 0,15 × 106 (livskraftiga) celler/ml. Ta 96-brunnsplattan med interdigiterade elektroder ur inkubatorn och ta bort mediet med en flerkanalig pipet. Fördela 100 μL av cellsuspensionen (motsvarande 15 × 103 celler i detta fall) per brunn i 96-brunnsplattan. Låt cellerna balansera i 15 minuter vid rumstemperatur innan du placerar dem i CEI-enheten. 4. Ställa in och driva CEI-analysen Placera inkubatorn som rymmer CEI-enhetens platthållare vid 37 °C och 5% CO2. Placera 96-brunnsplattan i enheten. Öppna enhetens programvara och konfigurera ett nytt experiment genom att klicka på Inställningar i fönstret Samla in data. Vänta tills den bärbara datorn ansluts till ECIS-enheten och konfigurera plattan genom att kontrollera brunnarnas impedanser. Kontrollera om alla brunnar är korrekt konfigurerade, vilket indikeras av en grön färg. Om inte, upprepa steg 4.2 tills alla brunnar är gröna. I fönstret Brunnskonfiguration väljer du matristypen enligt de kulturprogram som används. Välj Flera frekvens-/tidslägen.OBS: I detta läge mäter enheten impedansförändringar vid ett frekvensområde. Starta mätningen genom att klicka på Start.OBS: Realtidsimpedans kan övervakas på programvarans gränssnitt. Välj önskad frekvens som ska visas. I det här exemplet väljs 16 kHz. 5. Sammansatt beredning och inkubation OBS: Som ett exempel på en antiviral förening används labyrinthopeptin A1 (se materialtabell). Eftersom detta protokoll kan generaliseras till alla föreningar med potentiell antiviral aktivitet, hänvisar vi till det som “föreningen”. Tillåt att hela cellodlingsmediet utan tillsats av fetalt bovint serum (FBS) (s.k. analysbuffert) balanserar vid rumstemperatur. Håll föreningarna på is. Bered en 10x koncentrerad utspädning av varje förening i analysmedium i 5 ml polypropenrör. Späd föreningarna seriellt i analysmedium i 5 ml polypropenrör för att erhålla de önskade 10x-koncentrationerna. Pausa CEI-enheten genom att klicka på Pausa i fönstret Inställningar för datainsamling. Vänta tills den aktuella tidpunkten är klar och ta ut 96-brunnsplattan. Kontrollera vidhäftningen och monolagerbildningen av cellerna under ett ljusmikroskop. Ta bort 20 μL från varje brunn med en flerkanalig pipet. Tillsätt 20 μL sammansatt lösning eller vehikel i önskade brunnar. Förbered en layout med de specifika villkoren för korrekt pipettering. Inkubera plattan i 15 minuter vid 37 °C med 5 %CO2.OBS: En vanlig cellinkubator används för detta inkubationssteg istället för en CEI-enhet. Cellkontrollbrunnar (CC) är fordonsbehandlade brunnar. 6. Virusberedning och infektion Tina en flaska med viruslager. I det här exemplet används ZIKV MR766 och ZIKV PRVABC59. Bered virusutspädningar vid önskad MOI eller spädningar i analysmedium i ett 15 ml polypropenrör.I det här representativa exemplet används MOI 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001, 0,005 och 0,00005. Tillsätt 100 μL virusutspädning i de tilldelade brunnarna på 96-brunnsplattan. Tillsätt analysmedium till CC-brunnarna. Dekontaminera de använda virusbehållarna. Sätt tillbaka plattan i CEI-enheten och fortsätt mätningarna i 6 dagar i följd genom att klicka på Återuppta experiment.OBS: Viruskontrollbrunnar (VC) är vehikelbehandlade infekterade celler, medan i CC-brunnar tillsätts analysmedium istället för virusutspädning. Om föreningarnas cytotoxicitet utvärderas, tillsätt 100 μL analysbuffert i stället för virusspädning. 7. Analys av data Avsluta experimentet genom att klicka på Slutför och lägg till valfria sammanfattningskommentarer, till exempel information om de specifika experimentella förhållandena i fönstret som visas. Klicka på OK när datainsamlingen är klar. Välj önskad frekvens i diagramfönstret där den största impedansskillnaden mellan CC och VC mäts i slutet av experimentet.För att bestämma den bästa frekvensen, kör ett pilotexperiment med oinfekterade och infekterade celler och välj den frekvens som – vid den tidpunkt där impedansen hos de infekterade cellerna har sjunkit till sin baslinjenivå – leder till den största observerade impedansskillnaden mellan de oinfekterade och infekterade cellerna. När det gäller A549-celler infekterade med ZIKV är detta 16 kHz. Om du vill exportera alla data i kalkylbladsformat kontrollerar du att alla brunnar är markerade i fönstret Brunnskonfiguration och klickar på Arkiv | Exportera data | Diagram data. Normalisera data genom att subtrahera det genomsnittliga VC-impedansvärdet uppmätt i slutet av experimentet från alla datapunkter och dividera detta med det genomsnittliga CC-impedansvärdet för den sista tidpunkten som mättes före infektion. Plotta normaliserade data i tidsfunktionen för att erhålla CEI-profildiagram. Beräkna det normaliserade området under kurvan (AUCn) för varje tillstånd för att bestämma parametrar som 50% hämmande koncentrationer (IC50). Beräkna andra användbara parametrar, till exempel CIT50, för att till exempel jämföra smittsamheten hos olika virusstammar.

Representative Results

I denna artikel beskrivs användningen av CEI-analysen i ZIKV-forskning i detalj. Arbetsflödet för denna analys illustreras i figur 1. Vi demonstrerar bekvämligheten med realtidsövervakning av ZIKV-infektion i en önskad celltyp, samt utvärdering av infektionshämning av en antiviral förening. Som ett antiviralt exempel använder vi det väl beskrivna peptiden labyrinthopeptin A1 (Laby A1); Vi hänvisar till detta som “föreningen”, eftersom dess specifika egenskaper ligger utanför ramen för denna metodartikel och diskuteras någon annanstans20,21. Observera att metodens reproducerbarhet inte diskuteras i resultatavsnittet, eftersom vi vill fokusera på de enskilda impedansprofilerna som erhållits med hjälp av metoden. Detta har dock beskrivits tidigare19. I den första uppsättningen experiment visar vi vikten av celldensitetsoptimering vid utförande av CEI-infektionsanalyser (figur 2). När för många celler är sådda kommer cellmonolagret att ha vuxit helt och inte kunna spridas vidare över CEI-elektroderna. Detta leder till en mindre skillnad mellan CC och VC, och därmed en lägre upplösning, vilket minskar detektionsfönstret för antiviral aktivitet. Detta exemplifieras väl i figur 2E. För vissa större celltyper, såsom U87-celler, kan sådd av celler för tätt till och med leda till fullständig lossning av cellmonoskiktet vid manipulering av plattan, vilket visas här (figur 2F). Detta observeras också mikroskopiskt. Figur 2 visar också att analysen är mycket användbar för att utföra cellkänslighetsstudier. Det framgår tydligt av figur 2A,B att infektionskinetiken är starkt beroende av celltypen. Figur 2C visar att U87-celler endast är mottagliga för ZIKV-infektion vid höga MOI. I den andra uppsättningen experiment framhävs den mångsidiga användningen av CEI-infektionsanalysen med användning av olika ZIKV-stammar vid olika MOI och i närvaro av en välbeskriven antiviral förening (figur 3). Dessa experiment utförs med A549-celler, en modell som vanligtvis används i flavivirusforskning22,23. Denna cellinje har också använts i andra studier som har visat dess lämplighet i CEI-analyser24. För det första jämförs infektionskinetiken med en representativ ZIKV-stam av den afrikanska härstamningen MR766 med den asiatiska härstamningen PRVABC59. Figur 3A visar att båda stammarna har jämförbara CEI-mönster, där PRVABC59 har något långsammare CPE-inducerande egenskaper. Detta återspeglas också av CIT50-värdena (figur 3B). Denna intressanta parameter introducerades först av Fang et al.16 och tar hänsyn till kinetiken för CEI-mätningar. Det definieras som den tid som behövs för att minska impedansen med 50% jämfört med cellkontrollen. Därefter infekterades cellerna med tre olika MOI av antingen ZIKV MR766 eller PRVABC59, i närvaro eller frånvaro av olika föreningskoncentrationer, och impedansprofilerna övervakades. Som framgår av figur 3C-H hämmar eller fördröjer vissa koncentrationer av föreningar impedansfallet som orsakas av ZIKV-infektion. Detta återspeglas också när AUC-värdena beräknas. CEI-analysresultaten visar också visuellt att den antivirala aktiviteten beror på MOI och på tidpunkten för potensutvärdering. AUCn-beräkningar kan användas för att bestämma IC50-värden, vilket visas i figur 3I. Slutligen visar figur 3H att CIT50-värden också kan användas för att bestämma och jämföra sammansatta potenser. Inaktiva föreningar eller sammansatta koncentrationer kännetecknas av CEI-profiler, AUC och CIT50-värden jämförbara med VC. Figur 1: Schematisk översikt över analysens arbetsflöde. Tidslinjen och olika hanterings- och inkubationssteg för CEI-analysen visas här. Förkortningar: CEI = cellbaserad elektrisk impedans; ZIKV = Zika-virus; D = dagar. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 2: Normaliserade CEI-profiler av ZIKV-infekterade celler vid olika densiteter. (A,D) A549, (B,E) HEL 299 eller (C,F) U87-celler såddes vid (A-C) 15 000-20 000 (“optimala”) eller (D-F) 75 000 (“suboptimala”) celler per brunn i en 96-brunns CEI-platta. Efter 24 timmars impedansövervakning infekterades cellerna med tiofaldiga MOI-utspädningar av ZIKV MR766. Impedansen övervakades ytterligare under 5 dagar i följd. CEI-profiler (medelvärde ± intervallet för två tekniska replikat) för ett representativt experiment visas. Förkortningar: CEI = cellbaserad elektrisk impedans; MOI = multiplicitet av infektion; ZIKV = Zika-virus; Norm = normaliserad. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 3: Normaliserade CEI-profiler för A549-celler efter infektion med två ZIKV-stammar och hämning av en antiviral förening. (A) Adherenta A549-celler infekterades med olika MOI av antingen ZIKV MR766 eller ZIKV PRVABC59, och impedansen övervakades kontinuerligt. Medelvärdet ± SD för tre tekniska replikat av ett representativt experiment visas. (B) CIT50-värden beräknades på grundval av CEI-profilen för A och jämfördes. Medelvärdet ± SD för tre utförda tekniska replikat visas. (C-H) Adherent A549-celler behandlades med olika koncentrationer av föreningar och infekterades därefter med en specifik MOI av antingen ZIKV MR766 (C-E) eller ZIKV PRVABC59 (F-H). Impedansen övervakades kontinuerligt. Medelvärdet ± intervallet för två tekniska replikat av ett representativt experiment visas. (I) För att jämföra koncentrationshämning mot olika ZIKV-stammar och spädningar beräknades AUC n och hämmande procentsatser bestämdes genom att subtrahera alla tillstånd med CC AUC n och dividera med VC AUCn. (J) CIT50-värdena för experimentet som visas i C-H beräknades för att jämföra de olika ZIKV-stammarna och MOI. Medelvärdet ± intervallet för två tekniska replikat visas. Förkortningar: CEI = cellbaserad elektrisk impedans; MOI = multiplicitet av infektion; ZIKV = Zika-virus; Norm = normaliserad; CIT 50 = den tid då impedansen minskade med50 % jämfört med obehandlad kontrollgrupp, AUC = arean under kurvan, CC = cellkontroll; VC = viruskontroll. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Denna artikel beskriver användningen av CEI-analysen i ZIKV antiviral forskning. Analysen har fördelen av realtidsövervakning och kan därför användas för att utvärdera kinetiken för ZIKV-infektion och antiviral hämning med selektiva föreningar. De data som erhållits med denna metod möjliggör en objektiv och visuell observation av virusinducerad CPE och styrkan hos en potentiell antiviral förening.

Eftersom CEI är en mycket känslig metod måste stor försiktighet iakttas vid utförandet av denna cellulära analys. Det är viktigt att exakt pipettering utförs för att undvika pipettering variation så mycket som möjligt. Dessutom måste andra faktorer som kan påverka experimentella resultat, såsom cellantal och använt viralt lager, hållas konstant mellan experimentupprepningar. Dessa är faktorer som i hög grad påverkar kinetiken för celltillväxt och infektion och kan därför leda till variation i beräknade CIT_50-värden och/eller andra parametrar.

Vid utförande av CEI-analysen i närvaro av (potentiella) antivirala föreningar är det viktigt att bestämma om de påverkar cellernas impedans i frånvaro av ett virus. Tekniken är så känslig att impedansförändringar kan mätas långt under föreningens cytotoxiska koncentrationer¹⁹.

Även om endast ZIKV-data visas i den här artikeln kan analysen enkelt tillämpas på andra cytopatogena (flavi) virus, med endast minimal optimeringsinsats, såsom optimal CEI-övervakningsfrekvensbestämning. Anpassningar av CEI-analysen har använts med olika human- och djurvirus, såsom chikungunya, influensa A och humana och hästherpesvirus^25,26,27,28. Här används den också som en enkel metod för kvantifiering av virala titrar eller för identifiering av antivirala föreningar. Dessa studier använde realtidscellanalys, en alternativ CEI-metod.

Användningen av CEI-tekniken är begränsad till vidhäftande celltyper, eftersom analysens princip bygger på egenskaperna hos vidhäftande celler för att sprida sig över de elektrodinbäddade brunnarna. Tja ytbeläggningar såsom fibronektin kan användas för att förbättra cellfästning²⁹. Metoden har några andra nackdelar, den första relaterad till dess kostnad. Förutom investeringen i CEI-övervakningsenheten och medföljande hård- och mjukvara är förbrukningsvarorna också något dyra. Vidare, eftersom protokollet kräver övervakning av virusinfektion i flera dagar, kan en 96-brunnsplatta per vecka utvärderas. Tillsammans med den höga kostnaden begränsar detta användningen till inställningar med lågt till medelhögt dataflöde.

På grund av dessa genomströmningsproblem är tekniken olämplig för antivirala screeninginställningar. Det är dock mycket tilltalande i initiala experimentella faser, till exempel vid utvärdering av cellkänslighet för studier av ZIKV-infektion i en viss sjukdomsrelaterad miljö. Tekniken är också användbar med transfekterade eller knockout-cellinjer för att enkelt observera förändringar i infektionskinetik, till exempel i närvaro eller frånvaro av vissa inträdesreceptorer. Detta är intressant när man undersöker involveringen av cellulära faktorer vid ZIKV-infektion. Vidare, i senare prekliniska faser, när en viss huvudkandidat har valts, kan CEI-analysen användas för ytterligare djupgående karakterisering av en vald substans. CEI-biosensorer kan också modifieras genom immobilisering av vissa bioigenkänningselement, såsom virusspecifika antikroppar, för detektion av virus¹⁸. Sammantaget belyser detta den mångsidiga användningen av CEI i en virologimiljö.

Materials

A549 cells	American Type Culture Collection (ATCC)	CCL-185	These cells are cultured in MEM Rega-3 supplemented with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 0.075% sodium bicarbonate.
Acridine Orange/Propidium Iodide Stain	Logos Biosystems	F23001	Live/dead stain
Cellstar polypropylene tubes, 15 mL	Greiner bio-one	1,88,271
Cellstar polypropylene tubes, 50 mL	Greiner bio-one	2,27,261
Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	41965-039	Cell culture medium for U87 and HEL 299 cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	14190-094
ECIS cultureware 96W20idf	Applied BioPhysics	96W20idf PET	Assay plate for CEI device
Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) Z array station	Applied BioPhysics		CEI device, including 96 well station, external control module and laptop with control, acquisition and display software. The necessary software is installed before shipment. NOTE: this device is currently out of production and has been replaced by the more advanced ECIS Z-Theta device
Falcon polystyrene tubes, 5 mL	Corning	352054
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cytiva	SV30160.03	Cell culture medium additive for all used cells
HEL 299 cells	ATCC	CCL-137	These cells are cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 0.01 M HEPES.
HEPES buffer, 1 M	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15630-056	Cell culture medium additive for U87 cells
Labyrinthopeptin A1	Kind gift from Prof. Dr. Roderich Süssmuth, Technische Universität Berlin, Germany		Antiviral compound used as an example in this protocol. It is dissolved in DMSO.
L-Glutamine, 200 mM	Gibco, Thermo Fisher Scientific	25030-024	Cell culture medium additive for A549 cells
Luna cell counting slides	Logos Biosystems	L12001
Luna-FL dual fluoresence cell counter	Logos Biosystems	L20001	Cell viability counter
Minimum Essential Medium Rega-3 (MEM Rega-3)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	19993013	Cell culture medium for A549 cells
Sodium Bicarbonate, 7.5%	Gibco, Thermo Fisher Scientific	25080-060	Cell culture medium additive for A549 cells
Tissue culture flask T75	TPP	Y9076
Trypsin-EDTA, 0.25%	Gibco, Thermo Fisher Scientific	25200-056	Dissociation reagent
U87 cells	ATCC	HTB-14	These cells are cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 0.01 M HEPES.
Virkon Rely+On tablets	Lanxess	115-0020	Disinfectant sollution
Zika virus (ZIKV) MR766	ATCC	VR-84	ZIKV prototype strain, isolated from sentinel Rhesus monkey in Uganda in 1968
ZIKV PRVABC59	ATCC	VR-1843	ZIKV strain isolated from patient in Puerto Rico in 2015