أتمتة معالجة خشب براعم الحمضيات للكشف عن مسببات الأمراض النهائية من خلال هندسة الأدوات
Summary
لقد قمنا بتصميم وتصنيع والتحقق من صحة أداة تعالج بسرعة أنسجة خشب براعم الحمضيات الغنية باللحاء اللحاء. مقارنة بالطرق الحالية ، زاد مستخرج أنسجة البراعم (BTE) من إنتاجية العينة وقلل من تكاليف العمالة والمعدات المطلوبة.
Abstract
مسببات الأمراض المنقولة بالكسب غير المشروع ومحدودة اللحاء من الحمضيات مثل الفيروسات والفيروسات والبكتيريا هي المسؤولة عن الأوبئة المدمرة والخسائر الاقتصادية الجسيمة في جميع أنحاء العالم. على سبيل المثال ، قتل فيروس تريستيزا الحمضيات أكثر من 100 مليون شجرة حمضيات على مستوى العالم ، في حين أن “Candidatus Liberibacter asiaticus” كلف فلوريدا 9 مليارات دولار. يعد استخدام خشب براعم الحمضيات الذي تم اختباره بواسطة مسببات الأمراض لتكاثر الأشجار أمرا أساسيا لإدارة مسببات الأمراض هذه. يستخدم برنامج حماية استنساخ الحمضيات (CCPP) في جامعة كاليفورنيا ، ريفرسايد ، مقايسات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لاختبار آلاف العينات من أشجار مصدر خشب براعم الحمضيات كل عام لحماية الحمضيات في كاليفورنيا وتوفير وحدات إكثار نظيفة للشبكة الوطنية للنباتات النظيفة. عنق الزجاجة الشديد في الكشف الجزيئي عالي الإنتاجية لفيروسات الحمضيات والفيروسات هو خطوة معالجة الأنسجة النباتية.
يعد التحضير السليم للأنسجة أمرا بالغ الأهمية لاستخراج الأحماض النووية عالية الجودة واستخدامها في فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل. إن تقطيع الأنسجة النباتية ووزنها وتجفيفها بالتجميد وطحنها وطردها مركزيا في درجات حرارة منخفضة لتجنب تدهور الحمض النووي يستغرق وقتا طويلا ويتطلب عمالة مكثفة ويتطلب معدات مخبرية باهظة الثمن ومتخصصة. تقدم هذه الورقة التحقق من صحة أداة متخصصة مصممة لمعالجة أنسجة اللحاء الغنية باللحاء بسرعة من خشب براعم الحمضيات ، وتسمى مستخرج أنسجة خشب البراعم (BTE). يزيد BTE من إنتاجية العينة بنسبة 100٪ مقارنة بالطرق الحالية. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يقلل من العمالة وتكلفة المعدات. في هذا العمل ، كان لعينات BTE عائد DNA (80.25 نانوغرام / ميكرولتر) يمكن مقارنته ببروتوكول التقطيع اليدوي ل CCPP (77.84 نانوغرام / ميكرولتر). يمكن أن تفيد هذه الأداة وبروتوكول المعالجة السريعة للأنسجة النباتية العديد من مختبرات وبرامج تشخيص الحمضيات في كاليفورنيا وتصبح نظاما نموذجيا لمعالجة الأنسجة للمحاصيل الخشبية المعمرة الأخرى في جميع أنحاء العالم.
Introduction
تسببت مسببات الأمراض المحدودة باللحاء والمنقولة بالكسب غير المشروع للحمضيات ، مثل الفيروسات والفيروسات والبكتيريا ، في أوبئة مدمرة وخسائر اقتصادية خطيرة في كل منطقة منتجة للحمضيات في العالم. تحد فيروسات الحمضيات من عوامل الإنتاج بسبب أمراض القشرة الخارجية والدنف التي تسببها في أنواع الحمضيات المهمة اقتصاديا ، مثل الهجينة ثلاثية الأوراق ، والهجينة ثلاثية الأوراق ، واليوسفي ، والكليمنتين ، واليوسفي1،2،3. في كاليفورنيا ، تعد أنواع الحمضيات الحساسة للفيروسات هذه أساس السوق المتنامي والمربح ل “أدوات التقشير السهلة” ، بعد الاتجاه المتغير في تفضيل المستهلكين للفواكه التي يسهل تقشيرها وتجزئتها وبدون بذور4،5،6. وبالتالي ، يتم تنظيم فيروسات الحمضيات بموجب وزارة الأغذية والزراعة في كاليفورنيا (CDFA) “برنامج نظافة آفات مخزون مشاتل الحمضيات – مشروع قانون مجلس الشيوخ 140” ، وتقوم مختبرات فرع تشخيص الآفات النباتية التابع ل CDFA بإجراء الآلاف من اختبارات فيروس الحمضيات سنويا7،8،9،10. كان فيروس تريستيزا الحمضيات (CTV) مسؤولا عن وفاة أكثر من 100 مليون شجرة حمضيات منذ بداية الوباء العالمي في ثلاثينيات القرن العشرين3،9،10،11. في كاليفورنيا ، تشكل عزلات مقاومة كسر الساق والأوراق الثلاثية للفيروس تهديدا خطيرا لصناعة الحمضيات في كاليفورنيا التي تبلغ قيمتها 3.6 مليار دولار12،13،14. وبالتالي ، يصنف CDFA CTV على أنه آفة نباتية منظمة من الفئة A ، ويقوم مختبر وكالة القضاء على Tristeza في وسط كاليفورنيا (CCTEA) بإجراء مسوحات ميدانية مكثفة وآلاف اختبارات الفيروسات كل عام15,16. تشير التقديرات إلى أن بكتيريا “Candidatus Liberibacter asiaticus” (CLas) ومرض huanglongbing (HLB) قد تسببوا في ما يقرب من 9 مليارات دولار من الأضرار الاقتصادية لفلوريدا نتيجة لانخفاض مساحة الحمضيات بنسبة 40٪ ، وانخفاض بنسبة 57٪ في عمليات الحمضيات ، وفقدان ما يقرب من 8000 وظيفة17,18. في كاليفورنيا ، كان من المتوقع أن يؤدي انخفاض افتراضي بنسبة 20٪ في مساحة الحمضيات بسبب HLB إلى فقدان أكثر من 8,200 وظيفة وانخفاض يزيد عن نصف مليار دولار في الناتج المحلي الإجمالي للولاية. لذلك ، ينفق برنامج الوقاية من آفات الحمضيات والأمراض أكثر من 40 مليون دولار سنويا على المسوحات لاختبار واكتشاف واستئصال CLas من كاليفورنيا14،17،19،20.
أحد العناصر الرئيسية لإدارة فيروسات الحمضيات والفيروسات والبكتيريا هو استخدام مواد إكثارية مختبرة من قبل مسببات الأمراض (أي خشب البراعم) لإنتاج الأشجار. يتم إنتاج خشب براعم الحمضيات الذي تم اختباره بواسطة مسببات الأمراض وصيانته ضمن برامج الحجر الصحي الشاملة التي تستخدم تقنيات متقدمة للتخلص من مسببات الأمراض والكشفعنها 10,21. يقوم برنامج حماية استنساخ الحمضيات (CCPP) في جامعة كاليفورنيا ، ريفرسايد ، باختبار الآلاف من عينات خشب البراعم كل عام من أصناف الحمضيات المستوردة حديثا إلى الولاية والولايات المتحدة الأمريكية ، بالإضافة إلى أشجار مصدر خشب براعم الحمضيات ، لحماية حمضيات كاليفورنيا ودعم وظائف الشبكة الوطنية للنباتات النظيفة للحمضيات10،17،22. للتعامل مع الحجم الكبير من اختبارات الحمضيات ، تعد فحوصات الكشف عن مسببات الأمراض عالية الإنتاجية والموثوقة والفعالة من حيث التكلفة مكونا أساسيا لنجاح برامج مثل CCPP7،10،22.
في حين أن فحوصات الكشف عن مسببات الأمراض الجزيئية مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) قد سمحت بزيادات كبيرة في الإنتاجية في مختبرات التشخيص النباتي ، في تجربتنا ، فإن واحدة من أهم الاختناقات في تنفيذ البروتوكولات عالية الإنتاجية هي خطوة معالجة عينات الأنسجة النباتية. وينطبق هذا بشكل خاص على الحمضيات لأن البروتوكولات المتاحة حاليا لمعالجة الأنسجة الغنية باللحاء مثل أعناق الأوراق ولحاء خشب البراعم كثيفة العمالة وتستغرق وقتا طويلا وتتطلب معدات مخبرية باهظة الثمن ومتخصصة. تتطلب هذه البروتوكولات التقطيع اليدوي والوزن والتجفيف بالتجميد والطحن والطرد المركزي في درجات حرارة منخفضة لتجنب تدهور الحمض النووي8،23،24. على سبيل المثال ، في مختبر التشخيص CCPP ، تشمل معالجة العينات (i) التقطيع اليدوي (6-9 عينات / ساعة / مشغل) ، (ii) التجفيف بالتجميد (16-24 ساعة) ، (iii) السحق (30-60 ثانية) ، و (iv) الطرد المركزي (1-2 ساعة). تتطلب العملية أيضا إمدادات متخصصة (على سبيل المثال ، أنابيب القفل الآمن للخدمة الشاقة ، وكرات الطحن المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ ، والمحولات ، والشفرات ، والقفازات) وقطع متعددة من معدات المختبرات المكلفة (على سبيل المثال ، الفريزر المنخفض للغاية ، ومجفف التجميد ، وسحق الأنسجة ، وتبريد النيتروجين السائل ، وأجهزة الطرد المركزي المبردة).
كما هو الحال في أي صناعة ، تعد هندسة المعدات وأتمتة العمليات أساسية لخفض التكاليف وزيادة الإنتاجية وتوفير منتجات وخدمات موحدة عالية الجودة. تحتاج صناعة الحمضيات إلى أدوات معالجة الأنسجة منخفضة التكلفة التي تتطلب الحد الأدنى من المهارة لتشغيلها ، وعلى هذا النحو ، يسهل نقلها إلى مختبرات التشخيص والعمليات الميدانية للسماح بقدرة عالية على معالجة العينات للكشف السريع عن مسببات الأمراض. طورت شركة Technology Evolved Solutions (TES) و CCPP (أي التصميم والتصنيع) والتحقق من صحتها (أي اختبارها بعينات الحمضيات ومقارنتها بالإجراءات المختبرية القياسية) أداة منخفضة التكلفة (أي ألغت الحاجة إلى معدات مخبرية متخصصة) للمعالجة السريعة لأنسجة الحمضيات الغنية باللحاء (أي خشب البراعم) ، تسمى مستخرج أنسجة خشب البراعم (BTE). كما هو موضح في الشكل 1 ، يشتمل BTE على مكون أساسي للطاقة وأدوات التحكم ، بالإضافة إلى غرفة قابلة للإزالة لمعالجة خشب براعم الحمضيات. تتكون غرفة BTE من عجلة طحن مصممة خصيصا لتجريد أنسجة اللحاء الغنية باللحاء من خشب براعم الحمضيات. يتم إخراج أنسجة اللحاء الممزقة بسرعة من خلال منفذ منزلق إلى حقنة تحتوي على مخزن مؤقت للاستخراج ، ويتم ترشيحها وجعلها جاهزة لاستخراج الحمض النووي وتنقيته دون أي معالجة أو تحضير إضافي (الشكل 1). يتضمن نظام BTE أيضا تطبيقا لتتبع العينات غير الورقية وتطبيقا متكاملا للوزن ، والذي يسجل معلومات معالجة العينات في قاعدة بيانات عبر الإنترنت في الوقت الفعلي.
زاد نظام BTE من القدرة التشخيصية المعملية ل CCPP بأكثر من 100٪ وأنتج باستمرار مستخلصات أنسجة الحمضيات المناسبة لتنقية الأحماض النووية عالية الجودة والكشف النهائي عن مسببات الأمراض المنقولة بالكسب غير المشروع للحمضيات باستخدام فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل. وبشكل أكثر تحديدا ، قلل BTE من وقت معالجة الأنسجة من أكثر من 24 ساعة إلى ~ 3 دقائق لكل عينة ، واستبدل الأدوات المختبرية التي تكلف أكثر من 60000 دولار (الشكل 2 ، الخطوات 2-4) ، وسمح بمعالجة أحجام عينات أكبر.
تقدم هذه الورقة بيانات BTE عالية الإنتاجية لمعالجة أنسجة لحاء الحمضيات ، واستخراج الحمض النووي ، والتحقق من صحة الكشف عن مسببات الأمراض مع عينات من خشب براعم الحمضيات من أشجار المصدر ، بما في ذلك جميع الضوابط الإيجابية والسلبية المناسبة من مرفق الحجر الصحي CCPP Rubidoux ومرفق مؤسسة Lindcove ، على التوالي. نقدم أيضا تغييرات الإنتاجية ووقت المعالجة مقارنة بالإجراء المختبري الحالي (الشكل 2). بالإضافة إلى ذلك ، يوفر هذا العمل بروتوكولا مفصلا خطوة بخطوة لمختبرات اختبار مسببات الأمراض الحمضية ويوضح كيف يمكن ل BTE دعم وظائف مخزون الحضانة النظيف من مسببات الأمراض وبرامج المسح والاستئصال.
الشكل 1: مستخرج أنسجة خشب البراعم. يشتمل BTE على مكون أساسي للطاقة وأدوات التحكم ، بالإضافة إلى غرفة قابلة للإزالة لمعالجة خشب براعم الحمضيات. تتكون غرفة BTE من عجلة طحن مصممة خصيصا لتجريد أنسجة اللحاء الغنية باللحاء من خشب براعم الحمضيات. يتم إخراج أنسجة اللحاء الممزقة بسرعة من خلال منفذ منزلق إلى حقنة ، وتصفيتها ، وجعلها جاهزة لاستخراج الحمض النووي وتنقيته دون أي معالجة أو تحضير إضافي. اختصار: BTE = مستخرج أنسجة خشب البراعم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مقارنة خطوة بخطوة بين إجراء معمل التقطيع اليدوي التقليدي ومعالجة BTE. تتضمن معالجة BTE معالجة أنسجة لحاء الحمضيات عالية الإنتاجية ، واستخراج الحمض النووي ، واكتشاف مسببات الأمراض. يشار إلى وقت كل خطوة بين قوسين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
مع ظهور مرض الحمضيات HLB ، لتقليل الخسائر ، تم حث صناعة الحمضيات والوكالات التنظيمية ومختبرات التشخيص على الاعتماد على طرق استخراج الحمض النووي عالية الإنتاجية جنبا إلى جنب مع المعالجة اليدوية منخفضة الإنتاجية للعينات وفحوصات الكشف عن مسببات الأمراض مثل qPCR34 لاختبار الأشجار ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف المؤلفون بشعب كاهويلا باعتباره الوصي التقليدي على الأرض التي تم الانتهاء من العمل التجريبي عليها. نحن ممتنون للبروفيسور نورمان إلستراند في جامعة كاليفورنيا ، ريفرسايد ، لتوفير مساحة مختبرية لتنفيذ الأنشطة البحثية لهذا المشروع في إطار مبادرة UCR California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ). تم دعم هذا البحث من قبل CDFA – برنامج منحة كتلة المحاصيل المتخصصة (منحة رقم 18-0001-055-SC). وقدم أيضا دعم إضافي من مشروع CRB 6100؛ المعهد الوطني للأغذية والزراعة التابع لوزارة الزراعة الأمريكية ، 1020106 مشروع هاتش ؛ والشبكة الوطنية للنباتات النظيفة – خدمة فحص صحة الحيوان والنبات التابعة لوزارة الزراعة الأمريكية (AP17PPQS&T00C118 ، AP18PPQS&T00C107 ، AP19PPQS&T00C148 ، &AP20PPQS&T00C049) الممنوحة لجورجيوس فيدالاكيس.
Materials
| 0.08" Hex Trimmer line | PowerCare | FPRO07065 | Needed to replace blades. |
| 1 Hp, 8 gal air compressor | California Air Tools | 8010 | Quickly dry chambers after rinsed |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Globe Scientific | 111558B | Store sample in after swishing with syinges |
| 10 mL Syringe Set | Technology Evolving Solutions | TE006-F1-10A-G1000-E1 | Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING – contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required – do not mix with bleach |
| 12" Ruler | Westcott | 16012 | To measure trimmer line before cutting |
| 12% Sodium Hypochlorite | Hasa | 1041 | Disinfects chambers after processing |
| -20 C Freezer | Insignia | NS-CZ70WH0 | Store sample after processing |
| 4" x 12" plastic bags | Plymor | FP20-4×12-10 | Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal |
| 6" Cotton Swab | Puritan | 806-PCL | Swab to remove clogs |
| 7 Gallon Storage Tote | HDX | 206152 | Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers |
| Air blow gun | JASTIND | JTABG103A | Directs air into the chambers at high pressure |
| Black Sharpie | Sharpie | S-19421 | Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later |
| Bottle Top Dispensor | Brand | Z627569 | Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe |
| BTE Chamber | Technology Evolving Solutions | TE002BB-A05-E1 | Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool |
| Dish Soap | Dawn | 57445CT | Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber |
| Fume hood with hepa filter | Air Science | P5-36XT-A | Fume hood with hepa filter (ASTS-030) to limit possible contamination and protect against chemical spills |
| Insulated foam shipping container | PolarTech | 261/J50C | Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected |
| Lab coat | Red Kap | KP14WH LN 46 | Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills |
| Laptop | Microsoft | Surface | Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base |
| NFC Capable Phone | Samsung | Galaxy S9 | Phone to download and use TES phone app |
| NFC clip tag | Technology Evolving Solutions | TE005-Clip-E1 | Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app |
| NFC Collar Tag | Technology Evolving Solutions | TE005-Collar-E1 | Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app |
| Nitrile Gloves | Usa Scientific | 3915-4400 | Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills |
| Noise-Reducing Earmuff | 3M | 90565-4DC-PS | Protect ears while operating air compressor and tissue processing base |
| Polyurethane Recoil Air Hose | FYPower | 510019 | Attaches air gun to compressor |
| Saftey glasses | Solidwork | SW8329-US | Protect eyes for chemical and physical hazards |
| Spray bottle | JohnBee | B08QM81BJV | Spray bleach to deconatinate surfaces |
| Tissue Extractor Base | Technology Evolving Solutions | TE001-A-E1 | System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench |
| Tissue Processing Base Weight Scale | Technology Evolving Solutions | TE003-A05-200g-01-E1 | 200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield |
| Vermiculite | EasyGoProducts | B07WQDZGRP | Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service |
| Wire Cutter | Boenfu | BOWC-06002-US | Wire cutters to cut trimmer line |
Riferimenti
- Vernière, C., et al. Interactions between citrus viroids affect symptom expression and field performance of clementine trees grafted on trifoliate orange. Phytopathology. 96 (4), 356-368 (2006).
- Vernière, C., et al. Citrus viroids: Symptom expression and effect on vegetative growth and yield of clementine trees grafted on trifoliate orange. Plant Disease. 88 (11), 1189-1197 (2004).
- Zhou, C., Talon, M., Caruso, M., Gmitter, F. G., et al. Chapter 19 – Citrus viruses and viroids. The Genus Citrus. , 391-410 (2020).
- Trends and issues facing the U.S. citrus industry. Choices Magazine Online Available from: https://www.choicesmagazine.org/choices-magazine/theme-articles/trends-and-challenges-in-fruit-and-tree-nut-sectors/trends-and-issues-facing-the-us-citrus-industry (2021)
- Fruit and Tree Nuts Outlook. United States Department of Agriculture-Economic Research Service Available from: https://www.ers.usda.gov/webdocs/outlooks/98171/fts-370.pdf?v=5697 (2020)
- Forsyth, J., Fruits Damiani, J. C. i. t. r. u. s. Citrus Fruits. Types on the market. Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition. , 1329-1335 (2003).
- Bostock, R. M., Thomas, C. S., Hoenisch, R. W., Golino, D. A., Vidalakis, G. Plant health: How diagnostic networks and interagency partnerships protect plant systems from pests and pathogens. California Agriculture. 68 (4), 117-124 (2014).
- Osman, F., Dang, T., Bodaghi, S., Vidalakis, G. One-step multiplex RT-qPCR detects three citrus viroids from different genera in a wide range of hosts. Journal of Virological Methods. 245, 40-52 (2017).
- Wang, J., et al. Past and future of a century old Citrus tristeza virus collection: A California citrus germplasm tale. Frontiers in Microbiology. 4, 366 (2013).
- Gergerich, R. C., et al. Safeguarding fruit crops in the age of agricultural globalization. Plant Disease. 99 (2), 176-187 (2015).
- Moreno, P., Ambrós, S., Albiach-Martí, M. R., Guerri, J., Peña, L. Citrus tristeza virus: A pathogen that changed the course of the citrus industry. Molecular Plant Pathology. 9 (2), 251-268 (2008).
- Yokomi, R. K., et al. Identification and characterization of Citrus tristeza virus isolates breaking resistance in trifoliate orange in California. Phytopathology. 107 (7), 901-908 (2017).
- Selvaraj, V., Maheshwari, Y., Hajeri, S., Yokomi, R. A rapid detection tool for VT isolates of Citrus tristeza virus by immunocapture-reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification assay. PLoS One. 14 (9), 0222170 (2019).
- Babcock, B. A. Economic impact of California’s citrus industry in 2020. Journal of Citrus Pathology. 9, (2022).
- Gottwald, T. R., Polek, M., Riley, K. History, present incidence, and spatial distribution of Citrus tristeza virus in the California central valley. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15, (2002).
- Yokomi, R., et al. Molecular and biological characterization of a novel mild strain of citrus tristeza virus in California. Archives of Virology. 163 (7), 1795-1804 (2018).
- Fuchs, M., et al. Economic studies reinforce efforts to safeguard specialty crops in the United States. Plant Disease. 105 (1), 14-26 (2021).
- The real cost of HLB in Florida. Citrus Industry Magazine Available from: https://citrusindustry.net/2019/07/30/the-real-cost-of-hib-in-florida/ (2019)
- McRoberts, N., et al. Using models to provide rapid programme support for California’s efforts to suppress Huanglongbing disease of citrus. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 374 (1776), 20180281 (2019).
- Albrecht, C., et al. Action plan for Asian citrus psyllid and huanglongbing (citrus greening) in California. Journal of Citrus Pathology. 7 (1), (2020).
- Navarro, L., et al. The Citrus Variety Improvement Program in Spain in the period 1975-2001. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15 (15), (2002).
- Vidalakis, G., Gumpf, D. J., Polek, M. L., Bash, J. A., Ferguson, L., Grafton-Cardwell, E. E. The California Citrus Clonal Protection Program. Citrus Production Manual. , 117-130 (2014).
- Dang, T., Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G., et al. High-throughput RNA extraction from citrus tissues for the detection of viroids. In Viroids: Methods and Protocols. 2316, (2022).
- Osman, F., Vidalakis, G., Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. Real-time detection of viroids using singleplex and multiplex quantitative polymerase chain reaction. Viroids: Methods and Protocols. 2316, (2022).
- Li, R., et al. A reliable and inexpensive method of nucleic acid extraction for the PCR-based detection of diverse plant pathogens. Journal of Virological Methods. 154 (1-2), 48-55 (2008).
- Saponari, M., Manjunath, K., Yokomi, R. K. Quantitative detection of Citrus tristeza virus in citrus and aphids by real-time reverse transcription-PCR (TaqMan). Journal of Virological Methods. 147 (1), 43-53 (2008).
- Damaj, M. B., et al. Reproducible RNA preparation from sugarcane and citrus for functional genomic applications. International Journal of Plant Genomics. 2009, 765367 (2009).
- Dang, T., et al. First report of citrus leaf blotch virus infecting Bearss lime tree in California. Plant Disease. 104 (11), 3088 (2020).
- Manchester, K. L. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. BioTechniques. 20 (6), 968-970 (1996).
- Teare, J. M., et al. Measurement of nucleic acid concentrations using the DyNA QuantTM and the GeneQuantTM. BioTechniques. 22 (6), 1170-1174 (1997).
- Imbeaud, S. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 56-56 (2005).
- Menzel, W., Jelkmann, W., Maiss, E. Detection of four apple viruses by multiplex RT-PCR assays with coamplification of plant mRNA as internal control. Journal of Virological Methods. 99 (1-2), 81-92 (2002).
- Vidalakis, G., Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G., et al. SYBR Green RT-qPCR for the universal detection of citrus viroids. Viroids: Methods and Protocols. , 211-217 (2022).
- Arredondo Valdés, R., et al. A review of techniques for detecting Huanglongbing (greening) in citrus. Canadian Journal of Microbiology. 62 (10), 803-811 (2016).
- Li, S., Wu, F., Duan, Y., Singerman, A., Guan, Z. Citrus greening: Management strategies and their economic impact. HortScience. 55 (5), 604-612 (2020).
- . CDFA California Citrus Pest and Disease Prevention Program Operations Subcomittee Meeting. Meeting Minutes Available from: https://www.cdfa.ca.gov/citrus/docs/minutes/2019/OpsSubcoMinutes-11062019.pdf (2019)
