Automatisering van citrus budwood verwerking voor downstream pathogene detectie door middel van instrument engineering
Summary
We hebben een instrument ontworpen, gefabriceerd en gevalideerd dat snel floëemrijke schors citrusknophoutweefsels verwerkt. In vergelijking met de huidige methoden heeft de budwood tissue extractor (AHO) de monsterdoorvoer verhoogd en de vereiste arbeids- en apparatuurkosten verlaagd.
Abstract
Overdraagbare, floëembeperkte pathogenen van citrusvruchten zoals virussen, viroïden en bacteriën zijn verantwoordelijk voor verwoestende epidemieën en ernstige economische verliezen wereldwijd. Het citrus tristeza-virus doodde bijvoorbeeld wereldwijd meer dan 100 miljoen citrusbomen, terwijl “Candidatus Liberibacter asiaticus” Florida $ 9 miljard heeft gekost. Het gebruik van op ziekteverwekkers getest citrusknophout voor boomvermeerdering is de sleutel tot het beheer van dergelijke pathogenen. Het Citrus Clonal Protection Program (CCPP) aan de Universiteit van Californië, Riverside, gebruikt polymerasekettingreactie (PCR) -testen om elk jaar duizenden monsters van citrusknophoutbronbomen te testen om de citrusvruchten van Californië te beschermen en om schone vermeerderingseenheden te leveren aan het National Clean Plant Network. Een ernstig knelpunt in de high-throughput moleculaire detectie van citrusvirussen en viroïden is de stap van de verwerking van plantenweefsel.
Een goede weefselvoorbereiding is van cruciaal belang voor de extractie van hoogwaardige nucleïnezuren en downstream gebruik in PCR-testen. Plantenweefsel hakken, wegen, vriesdrogen, malen en centrifugeren bij lage temperaturen om nucleïnezuurafbraak te voorkomen is tijdsintensief en arbeidsintensief en vereist dure en gespecialiseerde laboratoriumapparatuur. Dit artikel presenteert de validatie van een gespecialiseerd instrument dat is ontworpen om snel floëemrijke schorsweefsels van citrusknophout te verwerken, de budwood tissue extractor (AHO). De AHO verhoogt de monsterdoorvoer met 100% in vergelijking met de huidige methoden. Bovendien vermindert het de arbeid en de kosten van apparatuur. In dit werk hadden de AHO-monsters een DNA-opbrengst (80,25 ng / μL) die vergelijkbaar was met het handhakkende protocol van de CCPP (77,84 ng / μL). Dit instrument en het snelle plantenweefselverwerkingsprotocol kunnen verschillende citrusdiagnoselaboratoria en -programma’s in Californië ten goede komen en een modelsysteem worden voor weefselverwerking voor andere houtachtige meerjarige gewassen wereldwijd.
Introduction
Transplantaat-overdraagbare floëem-beperkte pathogenen van citrusvruchten, zoals viroïden, virussen en bacteriën, hebben verwoestende epidemieën en ernstige economische verliezen veroorzaakt in elk citrusproducerend gebied van de wereld. Citrusviroïden beperken de productiefactoren vanwege de exocortis- en cachexieziekten die ze veroorzaken in economisch belangrijke citrussoorten, zoals trifoliaat, trifoliaathybriden, mandarijnen, clementines en mandarijnen 1,2,3. In Californië vormen deze viroïde-gevoelige citrussoorten de basis van de groeiende en winstgevende markt van “easy-peelers”, in navolging van de veranderende trend in de voorkeur van consumenten voor fruit dat gemakkelijk te schillen, gesegmenteerd en pitloos is 4,5,6. Zo worden citrusviroïden gereguleerd onder het California Department of Food and Agriculture (CDFA) “Citrus Nursery Stock Pest Cleanliness Program-Senate Bill 140”, en de laboratoria van CDFA’s Plant Pest Diagnostics Branch voeren jaarlijks duizenden citrusviroïde tests uit 7,8,9,10 . Citrus tristeza virus (CTV) is verantwoordelijk voor de dood van meer dan 100 miljoen citrusbomen sinds het begin van de wereldwijde epidemie in de jaren 1930 3,9,10,11. In Californië vormen stengelputjes en trifoliate brekende resistentie-isolaten van het virus een ernstige bedreiging voor de $ 3,6 miljard Californische citrusindustrie12,13,14. Bijgevolg classificeert CDFA CTV als een gereguleerde klasse-A plantenplaag en voert het laboratorium van het Central California Tristeza Eradication Agency (CCTEA) elk jaar uitgebreide veldonderzoeken en duizenden virustests uit15,16. De bacterie “Candidatus Liberibacter asiaticus” (CLas) en de huanglongbing (HLB) -ziekte hebben naar schatting bijna $ 9 miljard aan economische schade aan Florida veroorzaakt als gevolg van een vermindering van 40% van het citrusareaal, een afname van 57% in citrusactiviteiten en een verlies van bijna 8.000 banen17,18. In Californië werd voorspeld dat een hypothetische vermindering van 20% van het citrusareaal als gevolg van HLB zou resulteren in meer dan 8.200 banenverlies en een vermindering van meer dan een half miljard dollar in het bruto binnenlands product van de staat. Daarom besteedt het Citrus Pest and Disease Prevention Program jaarlijks meer dan $ 40 miljoen aan enquêtes om CLas uit Californië te testen, detecteren en uitroeien 14,17,19,20.
Een belangrijk element van het beheer van citrusviroïden, virussen en bacteriën is het gebruik van pathogeen-getest teeltmateriaal (d.w.z. budwood) voor de productie van bomen. Op pathogenen getest citrusknophout wordt geproduceerd en onderhouden binnen uitgebreide quarantaineprogramma’s die geavanceerde eliminatie- en detectietechnieken voor pathogenen gebruiken10,21. Het Citrus Clonal Protection Program (CCPP) aan de Universiteit van Californië, Riverside, test elk jaar duizenden knophoutmonsters van citrusvariëteiten die nieuw zijn geïmporteerd in de staat en de VS, evenals citrusknophoutbronbomen, om de citrusvruchten van Californië te beschermen en de functies van het National Clean Plant Network for Citrus10,17,22 te ondersteunen. Om het grote volume van citrustests aan te kunnen, zijn high-throughput, betrouwbare en kosteneffectieve pathogene detectietests een fundamenteel onderdeel voor het succes van programma’s zoals de CCPP 7,10,22.
Hoewel moleculaire pathogene detectietests zoals polymerasekettingreactie (PCR) hebben gezorgd voor een aanzienlijke toename van de doorvoer in fabrieksdiagnoselaboratoria, is in onze ervaring een van de meest kritieke knelpunten bij de implementatie van protocollen met hoge doorvoer de verwerkingsstap van plantenweefselmonsters. Dit geldt met name voor citrus omdat de momenteel beschikbare protocollen voor de verwerking van floëemrijke weefsels zoals bladstelen en knophoutschors arbeidsintensief en tijdrovend zijn en dure en gespecialiseerde laboratoriumapparatuur vereisen. Deze protocollen vereisen handhakken, wegen, vriesdrogen, malen en centrifugeren bij lage temperaturen om nucleïnezuurafbraak te voorkomen 8,23,24. In het CCPP-diagnoselaboratorium omvat monsterverwerking bijvoorbeeld (i) handhakken (6-9 monsters / h / operator), (ii) vriesdrogen (16-24 h), (iii) verpulvering (30-60 s) en (iv) centrifugeren (1-2 h). Het proces vereist ook gespecialiseerde benodigdheden (bijv. Heavy-duty safe-lock buizen, roestvrijstalen slijpballen, adapters, messen, handschoenen) en meerdere kostbare laboratoriumapparatuur (bijv. Ultra-lage vriezer, vriesdroger, weefselvergruizer, vloeibare stikstof cryostation, gekoelde centrifuge).
Zoals in elke branche zijn equipment engineering en de automatisering van processen de sleutel tot het verlagen van de kosten, het verhogen van de doorvoer en het leveren van hoogwaardige, uniforme producten en diensten. De citrusindustrie heeft goedkope weefselverwerkingsinstrumenten nodig die minimale vaardigheid vereisen om te werken en als zodanig gemakkelijk kunnen worden overgedragen aan diagnostische laboratoria en veldoperaties om een hoge monsterverwerkingscapaciteit mogelijk te maken voor snelle downstream pathogeendetectie. Technology Evolving Solutions (TES) en de CCPP ontwikkelden (d.w.z. ontwerpen en fabriceren) en valideerden (d.w.z. getest met citrusmonsters en vergeleken met standaard laboratoriumprocedures) een goedkoop (d.w.z. elimineerden de behoefte aan gespecialiseerde laboratoriumapparatuur) instrument voor de snelle verwerking van floëemrijke citrusweefsels (d.w.z. budwood), genaamd de budwood tissue extractor (AHO). Zoals te zien is in figuur 1, bevat de AHO een basiscomponent voor voeding en bedieningselementen, plus een verwijderbare kamer voor de verwerking van citrusknophout. De AHO-kamer bestaat uit een slijpschijf die speciaal is ontworpen om de floëemrijke schorsweefsels van het citrusknophout te strippen. Het versnipperde schorsweefsel wordt snel uitgeworpen via een schuifpoort in een spuit met extractiebuffer, gefilterd en klaargemaakt voor nucleïnezuurextractie en -zuivering zonder extra behandeling of voorbereiding (figuur 1). Het AHO-systeem omvat ook een papierloze monstervolgtoepassing en een geïntegreerde weegtoepassing, die de monsterverwerkingsinformatie in realtime in een online database registreert.
Het AHO-systeem heeft de laboratoriumdiagnostische capaciteit van het CCPP met meer dan 100% verhoogd en heeft consequent citrusweefselextracten geproduceerd die geschikt zijn voor de zuivering van hoogwaardige nucleïnezuren en de downstream-detectie van transplantaatoverdraagbare pathogenen van citrusvruchten met behulp van PCR-assays. Meer specifiek heeft AHO de tijd voor weefselverwerking teruggebracht van meer dan 24 uur tot ~ 3 minuten per monster, laboratoriuminstrumenten vervangen die meer dan $ 60.000 kosten (figuur 2, stappen 2-4) en de verwerking van grotere monstergroottes mogelijk gemaakt.
Dit artikel presenteert de AHO-high-throughput citrusschorsweefselverwerking, nucleïnezuurextractie en validatiegegevens voor pathogeendetectie met citrusknophoutmonsters van bronbomen, inclusief alle geschikte positieve en negatieve controles van respectievelijk de CCPP Rubidoux Quarantine Facility en Lindcove Foundation Facility. We presenteren ook de veranderingen in doorvoer en verwerkingstijd ten opzichte van de huidige laboratoriumprocedure (figuur 2). Bovendien biedt dit werk een gedetailleerd, stapsgewijs protocol voor testlaboratoria voor citruspathogenen en laat het zien hoe de AHO de functies van pathogeen-schone kwekerijen, enquête en uitroeiingsprogramma’s kan ondersteunen.
Figuur 1: Budwood tissue extractor. De AHO bevat een basiscomponent voor voeding en bedieningselementen, plus een verwijderbare kamer voor de verwerking van citrusknophout. De AHO-kamer bestaat uit een slijpschijf die speciaal is ontworpen om de floëemrijke schorsweefsels van citrusknophout te strippen. Het versnipperde schorsweefsel wordt snel door een schuifpoort in een spuit geworpen, gefilterd en klaargemaakt voor nucleïnezuurextractie en -zuivering zonder extra hantering of voorbereiding. Afkorting: AHO = budwood tissue extractor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Stapsgewijze vergelijking tussen de conventionele hand-hak lab procedure en AHO verwerking. AHO-verwerking omvat high-throughput citrusschorsweefselverwerking, nucleïnezuurextractie en detectie van pathogenen. De tijd voor elke stap wordt tussen haakjes aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met de komst van HLB-citrusziekte, om verliezen te verminderen, zijn de citrusindustrie, regelgevende instanties en diagnostische laboratoria aangespoord om te vertrouwen op nucleïnezuurextractiemethoden met hoge doorvoer in combinatie met handmatige monsterverwerking met lage doorvoer en pathogene detectietests zoals qPCR34 voor het testen van individuele bomen, in combinatie met ziektebeheerpraktijken35. De HLB-positiviteitsratio van Californië is gestegen van 0,01% in …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen het Cahuilla-volk als de traditionele bewaarders van het land waarop het experimentele werk werd voltooid. We zijn professor Norman Ellstrand van de Universiteit van Californië, Riverside, dankbaar voor het beschikbaar stellen van laboratoriumruimte om onderzoeksactiviteiten uit te voeren voor dit project in het kader van het UCR California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ) Initiative. Dit onderzoek werd ondersteund door het CDFA – Specialty Crop Block Grant Program (subsidie nr. 18-0001-055-SC). Aanvullende steun werd ook verleend door het CRB-project 6100; USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch project 1020106; en de National Clean Plant Network-USDA Animal and Plant Health Inspection Service (AP17PPQS&T00C118, AP18PPQS&T00C107, AP19PPQS&T00C148, &; AP20PPQS&T00C049) toegekend aan Georgios Vidalakis.
Materials
| 0.08" Hex Trimmer line | PowerCare | FPRO07065 | Needed to replace blades. |
| 1 Hp, 8 gal air compressor | California Air Tools | 8010 | Quickly dry chambers after rinsed |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Globe Scientific | 111558B | Store sample in after swishing with syinges |
| 10 mL Syringe Set | Technology Evolving Solutions | TE006-F1-10A-G1000-E1 | Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING – contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required – do not mix with bleach |
| 12" Ruler | Westcott | 16012 | To measure trimmer line before cutting |
| 12% Sodium Hypochlorite | Hasa | 1041 | Disinfects chambers after processing |
| -20 C Freezer | Insignia | NS-CZ70WH0 | Store sample after processing |
| 4" x 12" plastic bags | Plymor | FP20-4×12-10 | Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal |
| 6" Cotton Swab | Puritan | 806-PCL | Swab to remove clogs |
| 7 Gallon Storage Tote | HDX | 206152 | Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers |
| Air blow gun | JASTIND | JTABG103A | Directs air into the chambers at high pressure |
| Black Sharpie | Sharpie | S-19421 | Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later |
| Bottle Top Dispensor | Brand | Z627569 | Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe |
| BTE Chamber | Technology Evolving Solutions | TE002BB-A05-E1 | Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool |
| Dish Soap | Dawn | 57445CT | Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber |
| Fume hood with hepa filter | Air Science | P5-36XT-A | Fume hood with hepa filter (ASTS-030) to limit possible contamination and protect against chemical spills |
| Insulated foam shipping container | PolarTech | 261/J50C | Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected |
| Lab coat | Red Kap | KP14WH LN 46 | Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills |
| Laptop | Microsoft | Surface | Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base |
| NFC Capable Phone | Samsung | Galaxy S9 | Phone to download and use TES phone app |
| NFC clip tag | Technology Evolving Solutions | TE005-Clip-E1 | Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app |
| NFC Collar Tag | Technology Evolving Solutions | TE005-Collar-E1 | Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app |
| Nitrile Gloves | Usa Scientific | 3915-4400 | Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills |
| Noise-Reducing Earmuff | 3M | 90565-4DC-PS | Protect ears while operating air compressor and tissue processing base |
| Polyurethane Recoil Air Hose | FYPower | 510019 | Attaches air gun to compressor |
| Saftey glasses | Solidwork | SW8329-US | Protect eyes for chemical and physical hazards |
| Spray bottle | JohnBee | B08QM81BJV | Spray bleach to deconatinate surfaces |
| Tissue Extractor Base | Technology Evolving Solutions | TE001-A-E1 | System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench |
| Tissue Processing Base Weight Scale | Technology Evolving Solutions | TE003-A05-200g-01-E1 | 200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield |
| Vermiculite | EasyGoProducts | B07WQDZGRP | Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service |
| Wire Cutter | Boenfu | BOWC-06002-US | Wire cutters to cut trimmer line |
Riferimenti
- Vernière, C., et al. Interactions between citrus viroids affect symptom expression and field performance of clementine trees grafted on trifoliate orange. Phytopathology. 96 (4), 356-368 (2006).
- Vernière, C., et al. Citrus viroids: Symptom expression and effect on vegetative growth and yield of clementine trees grafted on trifoliate orange. Plant Disease. 88 (11), 1189-1197 (2004).
- Zhou, C., Talon, M., Caruso, M., Gmitter, F. G., et al. Chapter 19 – Citrus viruses and viroids. The Genus Citrus. , 391-410 (2020).
- Trends and issues facing the U.S. citrus industry. Choices Magazine Online Available from: https://www.choicesmagazine.org/choices-magazine/theme-articles/trends-and-challenges-in-fruit-and-tree-nut-sectors/trends-and-issues-facing-the-us-citrus-industry (2021)
- Fruit and Tree Nuts Outlook. United States Department of Agriculture-Economic Research Service Available from: https://www.ers.usda.gov/webdocs/outlooks/98171/fts-370.pdf?v=5697 (2020)
- Forsyth, J., Fruits Damiani, J. C. i. t. r. u. s. Citrus Fruits. Types on the market. Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition. , 1329-1335 (2003).
- Bostock, R. M., Thomas, C. S., Hoenisch, R. W., Golino, D. A., Vidalakis, G. Plant health: How diagnostic networks and interagency partnerships protect plant systems from pests and pathogens. California Agriculture. 68 (4), 117-124 (2014).
- Osman, F., Dang, T., Bodaghi, S., Vidalakis, G. One-step multiplex RT-qPCR detects three citrus viroids from different genera in a wide range of hosts. Journal of Virological Methods. 245, 40-52 (2017).
- Wang, J., et al. Past and future of a century old Citrus tristeza virus collection: A California citrus germplasm tale. Frontiers in Microbiology. 4, 366 (2013).
- Gergerich, R. C., et al. Safeguarding fruit crops in the age of agricultural globalization. Plant Disease. 99 (2), 176-187 (2015).
- Moreno, P., Ambrós, S., Albiach-Martí, M. R., Guerri, J., Peña, L. Citrus tristeza virus: A pathogen that changed the course of the citrus industry. Molecular Plant Pathology. 9 (2), 251-268 (2008).
- Yokomi, R. K., et al. Identification and characterization of Citrus tristeza virus isolates breaking resistance in trifoliate orange in California. Phytopathology. 107 (7), 901-908 (2017).
- Selvaraj, V., Maheshwari, Y., Hajeri, S., Yokomi, R. A rapid detection tool for VT isolates of Citrus tristeza virus by immunocapture-reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification assay. PLoS One. 14 (9), 0222170 (2019).
- Babcock, B. A. Economic impact of California’s citrus industry in 2020. Journal of Citrus Pathology. 9, (2022).
- Gottwald, T. R., Polek, M., Riley, K. History, present incidence, and spatial distribution of Citrus tristeza virus in the California central valley. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15, (2002).
- Yokomi, R., et al. Molecular and biological characterization of a novel mild strain of citrus tristeza virus in California. Archives of Virology. 163 (7), 1795-1804 (2018).
- Fuchs, M., et al. Economic studies reinforce efforts to safeguard specialty crops in the United States. Plant Disease. 105 (1), 14-26 (2021).
- The real cost of HLB in Florida. Citrus Industry Magazine Available from: https://citrusindustry.net/2019/07/30/the-real-cost-of-hib-in-florida/ (2019)
- McRoberts, N., et al. Using models to provide rapid programme support for California’s efforts to suppress Huanglongbing disease of citrus. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 374 (1776), 20180281 (2019).
- Albrecht, C., et al. Action plan for Asian citrus psyllid and huanglongbing (citrus greening) in California. Journal of Citrus Pathology. 7 (1), (2020).
- Navarro, L., et al. The Citrus Variety Improvement Program in Spain in the period 1975-2001. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15 (15), (2002).
- Vidalakis, G., Gumpf, D. J., Polek, M. L., Bash, J. A., Ferguson, L., Grafton-Cardwell, E. E. The California Citrus Clonal Protection Program. Citrus Production Manual. , 117-130 (2014).
- Dang, T., Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G., et al. High-throughput RNA extraction from citrus tissues for the detection of viroids. In Viroids: Methods and Protocols. 2316, (2022).
- Osman, F., Vidalakis, G., Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. Real-time detection of viroids using singleplex and multiplex quantitative polymerase chain reaction. Viroids: Methods and Protocols. 2316, (2022).
- Li, R., et al. A reliable and inexpensive method of nucleic acid extraction for the PCR-based detection of diverse plant pathogens. Journal of Virological Methods. 154 (1-2), 48-55 (2008).
- Saponari, M., Manjunath, K., Yokomi, R. K. Quantitative detection of Citrus tristeza virus in citrus and aphids by real-time reverse transcription-PCR (TaqMan). Journal of Virological Methods. 147 (1), 43-53 (2008).
- Damaj, M. B., et al. Reproducible RNA preparation from sugarcane and citrus for functional genomic applications. International Journal of Plant Genomics. 2009, 765367 (2009).
- Dang, T., et al. First report of citrus leaf blotch virus infecting Bearss lime tree in California. Plant Disease. 104 (11), 3088 (2020).
- Manchester, K. L. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. BioTechniques. 20 (6), 968-970 (1996).
- Teare, J. M., et al. Measurement of nucleic acid concentrations using the DyNA QuantTM and the GeneQuantTM. BioTechniques. 22 (6), 1170-1174 (1997).
- Imbeaud, S. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 56-56 (2005).
- Menzel, W., Jelkmann, W., Maiss, E. Detection of four apple viruses by multiplex RT-PCR assays with coamplification of plant mRNA as internal control. Journal of Virological Methods. 99 (1-2), 81-92 (2002).
- Vidalakis, G., Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G., et al. SYBR Green RT-qPCR for the universal detection of citrus viroids. Viroids: Methods and Protocols. , 211-217 (2022).
- Arredondo Valdés, R., et al. A review of techniques for detecting Huanglongbing (greening) in citrus. Canadian Journal of Microbiology. 62 (10), 803-811 (2016).
- Li, S., Wu, F., Duan, Y., Singerman, A., Guan, Z. Citrus greening: Management strategies and their economic impact. HortScience. 55 (5), 604-612 (2020).
- . CDFA California Citrus Pest and Disease Prevention Program Operations Subcomittee Meeting. Meeting Minutes Available from: https://www.cdfa.ca.gov/citrus/docs/minutes/2019/OpsSubcoMinutes-11062019.pdf (2019)
