אוטומציה של עיבוד Citrus Budwood לזיהוי פתוגנים במורד הזרם באמצעות הנדסת מכשירים
Summary
הנדסנו, יצרנו ותיקפנו מכשיר שמעבד במהירות רקמות עץ הדר עשירות בקליפת עץ הדר. בהשוואה לשיטות הנוכחיות, מחלץ רקמות Budwood (BTE) הגדיל את תפוקת הדגימה והפחית את עלויות העבודה והציוד הנדרשות.
Abstract
פתוגנים של פרי הדר כגון וירוסים, וירואידים וחיידקים, המועברים על ידי שתלים, אחראים למגיפות הרסניות ולהפסדים כלכליים חמורים ברחבי העולם. לדוגמה, נגיף טריסטזה הדרים הרג מעל 100 מיליון עצי הדר ברחבי העולם, בעוד “Candidatus Liberibacter asiaticus” עלה לפלורידה 9 מיליארד דולר. השימוש בעצי הדר שנבדקו בפתוגן לריבוי עצים הוא המפתח לניהול פתוגנים כאלה. התוכנית להגנה על שבטי הדרים (CCPP) באוניברסיטת קליפורניה, ריברסייד, משתמשת במבחני תגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי לבדוק אלפי דגימות מעצי מקור של עצי הדר מדי שנה כדי להגן על פרי ההדר של קליפורניה ולספק יחידות ריבוי נקיות לרשת הלאומית לצמחים נקיים. צוואר בקבוק חמור בזיהוי מולקולרי בתפוקה גבוהה של נגיפי הדר ווירואידים הוא שלב עיבוד רקמות הצמח.
הכנת רקמות נכונה היא קריטית למיצוי חומצות גרעין איכותיות ולשימוש במורד הזרם בבדיקות PCR. קיצוץ רקמות צמחים, שקילה, ייבוש בהקפאה, טחינה וצנטריפוגה בטמפרטורות נמוכות כדי למנוע פירוק חומצות גרעין גוזל זמן רב ודורש ציוד מעבדה יקר ומיוחד. מאמר זה מציג את האימות של מכשיר מיוחד שהונדס לעיבוד מהיר של רקמות קליפה עשירות בפלואם מעצי הדר, הנקרא מחלץ רקמות בודווד (BTE). ה- BTE מגדיל את תפוקת הדגימה ב- 100% בהשוואה לשיטות הנוכחיות. בנוסף, זה מקטין את העבודה ואת עלות הציוד. בעבודה זו, לדגימות BTE הייתה תפוקת דנ”א (80.25 ננוגרם/μL) שהייתה דומה לפרוטוקול החיתוך הידני של CCPP (77.84 ננוגרם/μL). מכשיר זה ופרוטוקול עיבוד רקמות הצמח המהיר יכולים להועיל למספר מעבדות ותוכניות אבחון הדרים בקליפורניה ולהפוך למערכת מודל לעיבוד רקמות עבור גידולים רב-שנתיים עציים אחרים ברחבי העולם.
Introduction
פתוגנים מוגבלים בפלואם של הדרים, כגון וירואידים, וירוסים וחיידקים, גרמו למגיפות הרסניות ולהפסדים כלכליים חמורים בכל אזור ייצור הדרים בעולם. וירואידים מפירות הדר מגבילים גורמי ייצור בגלל האקסוקורטיס ומחלות הקכקסיה שהם גורמים בסוגי הדרים חשובים מבחינה כלכלית, כגון טריפוליאט, כלאיים טריפוליאטים, מנדרינים, קלמנטינות ומנדרינות 1,2,3. בקליפורניה, סוגי הדרים רגישים לוירואידים אלה הם הבסיס לשוק הצומח והרווחי של “קולפים קלים”, בעקבות המגמה המשתנה בהעדפת הצרכנים לפירות קלים לקילוף, מפולחים ונטולי זרעים 4,5,6. לפיכך, וירואידים הדרים מוסדרים תחת מחלקת המזון והחקלאות של קליפורניה (CDFA) “Citrus Nursery Stock Pest Clean Program-Senate Bill 140”, והמעבדות של אגף אבחון מזיקים צמחיים של CDFA מבצעות אלפי בדיקות וירואידים של הדרים בשנה 7,8,9,10 . נגיף ההדר טריסטזה (CTV) אחראי למותם של למעלה מ -100 מיליון עצי הדר מאז תחילת המגיפה העולמית בשנות השלושים 3,9,10,11. בקליפורניה, פיטינג גזע ועמידות לשבירת טריפוליאט של הנגיף מהווים איום רציני על תעשיית ההדרים בקליפורניה שמגלגלת 3.6 מיליארד דולר. כתוצאה מכך, CDFA מסווג CTV כמזיק צמחי מוסדר מסוג A, והמעבדה של הסוכנות למיגור טריסטזה במרכז קליפורניה (CCTEA) מבצעת סקרי שדה נרחבים ואלפי בדיקות וירוסים מדי שנה15,16. על פי הערכות, החיידק “Candidatus Liberibacter asiaticus” (CLas) ומחלת הואנגלונגבינג (HLB) גרמו לנזק כלכלי של קרוב ל-9 מיליארד דולר לפלורידה כתוצאה מירידה של 40% בשטחי ההדרים, ירידה של 57% בפעילות ההדרים ואובדן של כמעט 8,000 מקומות עבודה17,18. בקליפורניה, הפחתה היפותטית של 20% בשטחי ההדרים עקב HLB הייתה צפויה לגרום לאובדן של יותר מ-8,200 מקומות עבודה ולהפחתה של יותר מחצי מיליארד דולר בתוצר המקומי הגולמי של המדינה. לכן, התוכנית למניעת מזיקים ומחלות הדרים מוציאה מעל 40 מיליון דולר בשנה על סקרים לבדיקה, זיהוי ומיגור CLas מקליפורניה14,17,19,20.
מרכיב מרכזי בניהול וירואידים הדרים, וירוסים וחיידקים הוא השימוש בחומרי ריבוי שנבדקו על ידי פתוגן (כלומר, עצי ניצן) לייצור עצים. עצי הדר שנבדקו בפתוגן מיוצרים ומתוחזקים במסגרת תוכניות הסגר מקיפות המשתמשות בטכניקות מתקדמות לסילוק וזיהוי פתוגנים10,21. התוכנית להגנת שבטי הדרים (CCPP) באוניברסיטת קליפורניה, ריברסייד, בודקת אלפי דגימות של עצי ניצן מדי שנה מזני הדרים שיובאו לאחרונה למדינה ולארה”ב, כמו גם עצי מקור של עצי הדר, כדי להגן על פרי ההדר של קליפורניה ולתמוך בפונקציות של רשת הצמחים הנקיים הלאומית להדרים10,17,22. כדי להתמודד עם הנפח הגדול של בדיקות הדרים, בדיקות זיהוי פתוגנים בעלות תפוקה גבוהה, אמינות וחסכוניות הן מרכיב בסיסי להצלחתן של תוכניות כגון CCPP 7,10,22.
בעוד שמבחני זיהוי פתוגנים מבוססי מולקולרית כגון תגובת שרשרת פולימראז (PCR) אפשרו עלייה משמעותית בתפוקה במעבדות אבחון צמחיות, מניסיוננו, אחד מצווארי הבקבוק הקריטיים ביותר ביישום פרוטוקולים בעלי תפוקה גבוהה הוא שלב עיבוד דגימות רקמת הצמח. זה נכון במיוחד עבור הדרים מכיוון שהפרוטוקולים הזמינים כיום לעיבוד רקמות עשירות בפלואם כגון פטיולים של עלים וקליפת עץ ניצן הם עתירי עבודה, גוזלים זמן רב ודורשים ציוד מעבדה יקר ומיוחד. פרוטוקולים אלה דורשים קיצוץ ידני, שקילה, ייבוש בהקפאה, טחינה וצנטריפוגה בטמפרטורות נמוכות כדי למנוע התפרקות חומצות גרעין 8,23,24. לדוגמה, במעבדת האבחון CCPP, עיבוד הדגימות כולל (i) חיתוך ידני (6-9 דגימות/h/מפעיל), (ii) ייבוש בהקפאה (16-24 שעות), (iii) כתישה (30-60 שניות) ו-(iv) צנטריפוגה (1-2 שעות). התהליך דורש גם אספקה מיוחדת (למשל, צינורות כבדים לנעילת כספות, כדורי טחינה מנירוסטה, מתאמים, להבים, כפפות) וחלקים מרובים של ציוד מעבדה יקר (למשל, מקפיא נמוך במיוחד, מייבש בהקפאה, כתישת רקמות, הקפאת חנקן נוזלי, צנטריפוגה בקירור).
כמו בכל ענף, הנדסת ציוד ואוטומציה של תהליכים הם המפתח להוזלת עלויות, הגדלת התפוקה ואספקת מוצרים ושירותים איכותיים ואחידים. תעשיית ההדרים זקוקה למכשירים זולים לעיבוד רקמות הדורשים מיומנות מינימלית להפעלה, וככאלה, קל להעביר אותם למעבדות אבחון ותפעול בשטח כדי לאפשר יכולת עיבוד דגימה גבוהה לזיהוי פתוגן מהיר במורד הזרם. Technology Evolving Solutions (TES) וה-CCPP פיתחו (כלומר, תכננו וייצרו) ותיקפו (כלומר, נבדקו עם דגימות הדרים והושוו לנוהלי מעבדה סטנדרטיים) מכשיר בעלות נמוכה (כלומר, ביטלו את הצורך בציוד מעבדה מיוחד) לעיבוד מהיר של רקמות הדרים עשירות בפלואם (כלומר, Budwood), בשם Budwood Tissue Extractor (BTE). כפי שניתן לראות באיור 1, ה-BTE כולל רכיב בסיס להספק ולפקדים, בתוספת תא נשלף לעיבוד עצי הדר. תא ה-BTE מורכב מגלגל השחזה שתוכנן במיוחד כדי להסיר את רקמות הקליפה העשירות בפלואם מעץ ההדר. רקמת הקליפה הגרוסה נפלטת במהירות דרך פתח החלקה לתוך מזרק המכיל חיץ מיצוי, מסוננת ומוכנה למיצוי וטיהור חומצות גרעין ללא כל טיפול או הכנה נוספים (איור 1). מערכת BTE כוללת גם אפליקציה למעקב אחר דגימות ללא נייר ואפליקציית שקילה משולבת, המתעדות את עיבוד הדגימה במסד נתונים מקוון בזמן אמת.
מערכת BTE הגדילה את יכולת אבחון המעבדה של CCPP ביותר מ-100% וייצרה באופן עקבי תמציות רקמת הדרים המתאימות לטיהור חומצות גרעין באיכות גבוהה ולזיהוי במורד הזרם של פתוגנים הניתנים להעברה בשתלים של הדרים באמצעות בדיקות PCR. באופן ספציפי יותר, BTE צמצם את זמן עיבוד הרקמה מיותר מ-24 שעות ל~3 דקות לדגימה, החליף מכשירי מעבדה שעלותם מעל 60,000 דולר (איור 2, שלבים 2-4), ואיפשר עיבוד של דגימות גדולות יותר.
מאמר זה מציג את נתוני עיבוד רקמת קליפת ההדר BTE בתפוקה גבוהה, מיצוי חומצות גרעין ואימות זיהוי פתוגנים עם דגימות עצי הדר מעצי מקור, כולל כל הבקרות החיוביות והשליליות המתאימות ממתקן ההסגר CCPP Rubidoux ומתקן קרן לינדקוב, בהתאמה. אנו מציגים גם את השינויים בתפוקה ובזמן העיבוד בהשוואה לנוהל המעבדה הנוכחי (איור 2). בנוסף, עבודה זו מספקת פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב עבור מעבדות לבדיקת פתוגן הדרים ומדגימה כיצד BTE יכול לתמוך בפונקציות של מלאי משתלה נקי מפתוגנים, סקר ותוכניות מיגור.
איור 1: מחלץ רקמות Budwood. ה- BTE כולל רכיב בסיס להספק ובקרות, בתוספת תא נשלף לעיבוד עץ ניצן הדרים. תא ה-BTE מורכב מגלגל השחזה שתוכנן במיוחד כדי להסיר את רקמות הקליפה העשירות בפלואם מניצני הדרים. רקמת הקליפה הגרוסה נפלטת במהירות דרך פתח החלקה לתוך מזרק, מסוננת ומוכנה למיצוי וטיהור חומצות גרעין ללא כל טיפול או הכנה נוספים. קיצור: BTE = מחלץ רקמת ניצן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: השוואה שלב אחר שלב בין הליך המעבדה הקונבנציונלי לחיתוך ידני לבין עיבוד BTE. עיבוד BTE כולל עיבוד רקמת קליפת הדרים בתפוקה גבוהה, מיצוי חומצות גרעין וזיהוי פתוגנים. הזמן עבור כל שלב מצוין בסוגריים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
עם הופעתה של מחלת ההדרים HLB, כדי להפחית הפסדים, תעשיית ההדרים, סוכנויות רגולטוריות ומעבדות אבחון נקראו להסתמך על שיטות מיצוי חומצות גרעין בתפוקה גבוהה בשילוב עם עיבוד דגימות ידני בתפוקה נמוכה ומבחני זיהוי פתוגנים כגון qPCR34 לבדיקת עצים בודדים, בשילוב עם שיטות ניהול מחלות<sup class="…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מכירים באנשי קאווילה כאפוטרופוסים המסורתיים של הארץ שעליה הושלמה העבודה הניסיונית. אנו אסירי תודה לפרופסור נורמן אלסטרנד מאוניברסיטת קליפורניה, ריברסייד, על שסיפק שטח מעבדה לביצוע פעילויות מחקר עבור פרויקט זה במסגרת יוזמת UCR California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ). מחקר זה נתמך על ידי CDFA – Specialty Crop Block Grant Program (מענק מס’ 18-0001-055-SC). תמיכה נוספת ניתנה גם על ידי פרויקט CRB 6100; המכון הלאומי למזון וחקלאות של USDA, פרויקט Hatch 1020106; ו-National Clean Plant Network-USDA Animal and Plant Inspection Service (AP17PPQS&T00C118, AP18PPQS&T00C107, AP19PPQS&T00C148 &AP20PPQS&T00C049) שהוענק לגאורגיוס וידאלאקיס.
Materials
| 0.08" Hex Trimmer line | PowerCare | FPRO07065 | Needed to replace blades. |
| 1 Hp, 8 gal air compressor | California Air Tools | 8010 | Quickly dry chambers after rinsed |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Globe Scientific | 111558B | Store sample in after swishing with syinges |
| 10 mL Syringe Set | Technology Evolving Solutions | TE006-F1-10A-G1000-E1 | Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING – contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required – do not mix with bleach |
| 12" Ruler | Westcott | 16012 | To measure trimmer line before cutting |
| 12% Sodium Hypochlorite | Hasa | 1041 | Disinfects chambers after processing |
| -20 C Freezer | Insignia | NS-CZ70WH0 | Store sample after processing |
| 4" x 12" plastic bags | Plymor | FP20-4×12-10 | Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal |
| 6" Cotton Swab | Puritan | 806-PCL | Swab to remove clogs |
| 7 Gallon Storage Tote | HDX | 206152 | Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers |
| Air blow gun | JASTIND | JTABG103A | Directs air into the chambers at high pressure |
| Black Sharpie | Sharpie | S-19421 | Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later |
| Bottle Top Dispensor | Brand | Z627569 | Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe |
| BTE Chamber | Technology Evolving Solutions | TE002BB-A05-E1 | Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool |
| Dish Soap | Dawn | 57445CT | Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber |
| Fume hood with hepa filter | Air Science | P5-36XT-A | Fume hood with hepa filter (ASTS-030) to limit possible contamination and protect against chemical spills |
| Insulated foam shipping container | PolarTech | 261/J50C | Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected |
| Lab coat | Red Kap | KP14WH LN 46 | Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills |
| Laptop | Microsoft | Surface | Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base |
| NFC Capable Phone | Samsung | Galaxy S9 | Phone to download and use TES phone app |
| NFC clip tag | Technology Evolving Solutions | TE005-Clip-E1 | Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app |
| NFC Collar Tag | Technology Evolving Solutions | TE005-Collar-E1 | Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app |
| Nitrile Gloves | Usa Scientific | 3915-4400 | Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills |
| Noise-Reducing Earmuff | 3M | 90565-4DC-PS | Protect ears while operating air compressor and tissue processing base |
| Polyurethane Recoil Air Hose | FYPower | 510019 | Attaches air gun to compressor |
| Saftey glasses | Solidwork | SW8329-US | Protect eyes for chemical and physical hazards |
| Spray bottle | JohnBee | B08QM81BJV | Spray bleach to deconatinate surfaces |
| Tissue Extractor Base | Technology Evolving Solutions | TE001-A-E1 | System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench |
| Tissue Processing Base Weight Scale | Technology Evolving Solutions | TE003-A05-200g-01-E1 | 200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield |
| Vermiculite | EasyGoProducts | B07WQDZGRP | Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service |
| Wire Cutter | Boenfu | BOWC-06002-US | Wire cutters to cut trimmer line |
Riferimenti
- Vernière, C., et al. Interactions between citrus viroids affect symptom expression and field performance of clementine trees grafted on trifoliate orange. Phytopathology. 96 (4), 356-368 (2006).
- Vernière, C., et al. Citrus viroids: Symptom expression and effect on vegetative growth and yield of clementine trees grafted on trifoliate orange. Plant Disease. 88 (11), 1189-1197 (2004).
- Zhou, C., Talon, M., Caruso, M., Gmitter, F. G., et al. Chapter 19 – Citrus viruses and viroids. The Genus Citrus. , 391-410 (2020).
- Trends and issues facing the U.S. citrus industry. Choices Magazine Online Available from: https://www.choicesmagazine.org/choices-magazine/theme-articles/trends-and-challenges-in-fruit-and-tree-nut-sectors/trends-and-issues-facing-the-us-citrus-industry (2021)
- Fruit and Tree Nuts Outlook. United States Department of Agriculture-Economic Research Service Available from: https://www.ers.usda.gov/webdocs/outlooks/98171/fts-370.pdf?v=5697 (2020)
- Forsyth, J., Fruits Damiani, J. C. i. t. r. u. s. Citrus Fruits. Types on the market. Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition. , 1329-1335 (2003).
- Bostock, R. M., Thomas, C. S., Hoenisch, R. W., Golino, D. A., Vidalakis, G. Plant health: How diagnostic networks and interagency partnerships protect plant systems from pests and pathogens. California Agriculture. 68 (4), 117-124 (2014).
- Osman, F., Dang, T., Bodaghi, S., Vidalakis, G. One-step multiplex RT-qPCR detects three citrus viroids from different genera in a wide range of hosts. Journal of Virological Methods. 245, 40-52 (2017).
- Wang, J., et al. Past and future of a century old Citrus tristeza virus collection: A California citrus germplasm tale. Frontiers in Microbiology. 4, 366 (2013).
- Gergerich, R. C., et al. Safeguarding fruit crops in the age of agricultural globalization. Plant Disease. 99 (2), 176-187 (2015).
- Moreno, P., Ambrós, S., Albiach-Martí, M. R., Guerri, J., Peña, L. Citrus tristeza virus: A pathogen that changed the course of the citrus industry. Molecular Plant Pathology. 9 (2), 251-268 (2008).
- Yokomi, R. K., et al. Identification and characterization of Citrus tristeza virus isolates breaking resistance in trifoliate orange in California. Phytopathology. 107 (7), 901-908 (2017).
- Selvaraj, V., Maheshwari, Y., Hajeri, S., Yokomi, R. A rapid detection tool for VT isolates of Citrus tristeza virus by immunocapture-reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification assay. PLoS One. 14 (9), 0222170 (2019).
- Babcock, B. A. Economic impact of California’s citrus industry in 2020. Journal of Citrus Pathology. 9, (2022).
- Gottwald, T. R., Polek, M., Riley, K. History, present incidence, and spatial distribution of Citrus tristeza virus in the California central valley. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15, (2002).
- Yokomi, R., et al. Molecular and biological characterization of a novel mild strain of citrus tristeza virus in California. Archives of Virology. 163 (7), 1795-1804 (2018).
- Fuchs, M., et al. Economic studies reinforce efforts to safeguard specialty crops in the United States. Plant Disease. 105 (1), 14-26 (2021).
- The real cost of HLB in Florida. Citrus Industry Magazine Available from: https://citrusindustry.net/2019/07/30/the-real-cost-of-hib-in-florida/ (2019)
- McRoberts, N., et al. Using models to provide rapid programme support for California’s efforts to suppress Huanglongbing disease of citrus. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 374 (1776), 20180281 (2019).
- Albrecht, C., et al. Action plan for Asian citrus psyllid and huanglongbing (citrus greening) in California. Journal of Citrus Pathology. 7 (1), (2020).
- Navarro, L., et al. The Citrus Variety Improvement Program in Spain in the period 1975-2001. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15 (15), (2002).
- Vidalakis, G., Gumpf, D. J., Polek, M. L., Bash, J. A., Ferguson, L., Grafton-Cardwell, E. E. The California Citrus Clonal Protection Program. Citrus Production Manual. , 117-130 (2014).
- Dang, T., Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G., et al. High-throughput RNA extraction from citrus tissues for the detection of viroids. In Viroids: Methods and Protocols. 2316, (2022).
- Osman, F., Vidalakis, G., Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. Real-time detection of viroids using singleplex and multiplex quantitative polymerase chain reaction. Viroids: Methods and Protocols. 2316, (2022).
- Li, R., et al. A reliable and inexpensive method of nucleic acid extraction for the PCR-based detection of diverse plant pathogens. Journal of Virological Methods. 154 (1-2), 48-55 (2008).
- Saponari, M., Manjunath, K., Yokomi, R. K. Quantitative detection of Citrus tristeza virus in citrus and aphids by real-time reverse transcription-PCR (TaqMan). Journal of Virological Methods. 147 (1), 43-53 (2008).
- Damaj, M. B., et al. Reproducible RNA preparation from sugarcane and citrus for functional genomic applications. International Journal of Plant Genomics. 2009, 765367 (2009).
- Dang, T., et al. First report of citrus leaf blotch virus infecting Bearss lime tree in California. Plant Disease. 104 (11), 3088 (2020).
- Manchester, K. L. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. BioTechniques. 20 (6), 968-970 (1996).
- Teare, J. M., et al. Measurement of nucleic acid concentrations using the DyNA QuantTM and the GeneQuantTM. BioTechniques. 22 (6), 1170-1174 (1997).
- Imbeaud, S. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 56-56 (2005).
- Menzel, W., Jelkmann, W., Maiss, E. Detection of four apple viruses by multiplex RT-PCR assays with coamplification of plant mRNA as internal control. Journal of Virological Methods. 99 (1-2), 81-92 (2002).
- Vidalakis, G., Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G., et al. SYBR Green RT-qPCR for the universal detection of citrus viroids. Viroids: Methods and Protocols. , 211-217 (2022).
- Arredondo Valdés, R., et al. A review of techniques for detecting Huanglongbing (greening) in citrus. Canadian Journal of Microbiology. 62 (10), 803-811 (2016).
- Li, S., Wu, F., Duan, Y., Singerman, A., Guan, Z. Citrus greening: Management strategies and their economic impact. HortScience. 55 (5), 604-612 (2020).
- . CDFA California Citrus Pest and Disease Prevention Program Operations Subcomittee Meeting. Meeting Minutes Available from: https://www.cdfa.ca.gov/citrus/docs/minutes/2019/OpsSubcoMinutes-11062019.pdf (2019)
