इंस्ट्रूमेंट इंजीनियरिंग के माध्यम से डाउनस्ट्रीम रोगज़नक़ का पता लगाने के लिए साइट्रस बडवुड प्रोसेसिंग को स्वचालित करना
Summary
हमने एक उपकरण को इंजीनियर, निर्मित और मान्य किया जो फ्लोएम समृद्ध छाल साइट्रस बडवुड ऊतकों को तेजी से संसाधित करता है। वर्तमान तरीकों की तुलना में, बडवुड ऊतक एक्सट्रैक्टर (बीटीई) ने नमूना थ्रूपुट में वृद्धि की है और आवश्यक श्रम और उपकरण लागत में कमी आई है।
Abstract
वायरस, वाइरोइड्स और बैक्टीरिया जैसे साइट्रस के ग्राफ्ट-पारगम्य, फ्लोएम-सीमित रोगजनक दुनिया भर में विनाशकारी महामारी और गंभीर आर्थिक नुकसान के लिए जिम्मेदार हैं। उदाहरण के लिए, साइट्रस ट्राइस्टेजा वायरस ने विश्व स्तर पर 100 मिलियन से अधिक साइट्रस पेड़ों को मार डाला, जबकि “कैंडिडाटस लिबिबैक्टर एशियाटिकस” ने फ्लोरिडा को $ 9 बिलियन खर्च किए हैं। पेड़ के प्रसार के लिए रोगज़नक़-परीक्षण किए गए साइट्रस बडवुड का उपयोग ऐसे रोगजनकों के प्रबंधन के लिए महत्वपूर्ण है। कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, रिवरसाइड में साइट्रस क्लोनल प्रोटेक्शन प्रोग्राम (सीसीपीपी) कैलिफोर्निया के साइट्रस की रक्षा और राष्ट्रीय स्वच्छ संयंत्र नेटवर्क को स्वच्छ प्रसार इकाइयां प्रदान करने के लिए हर साल साइट्रस बडवुड स्रोत पेड़ों से हजारों नमूनों का परीक्षण करने के लिए पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) परख का उपयोग करता है। साइट्रस वायरस और वाइरोइड्स के उच्च-थ्रूपुट आणविक पहचान में एक गंभीर बाधा पौधे के ऊतक प्रसंस्करण चरण है।
पीसीआर परख में गुणवत्ता वाले न्यूक्लिक एसिड और डाउनस्ट्रीम उपयोग के निष्कर्षण के लिए उचित ऊतक तैयारी महत्वपूर्ण है। न्यूक्लिक एसिड क्षरण से बचने के लिए कम तापमान पर पौधे के ऊतकों को काटना, तौलना, फ्रीज-सुखाने, पीसने और सेंट्रीफ्यूजेशन समय-गहन और श्रम-गहन है और इसके लिए महंगे और विशेष प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता होती है। यह पेपर साइट्रस बडवुड से फ्लोएम युक्त छाल के ऊतकों को तेजी से संसाधित करने के लिए इंजीनियर किए गए एक विशेष उपकरण के सत्यापन को प्रस्तुत करता है, जिसे बडवुड ऊतक एक्सट्रैक्टर (बीटीई) नाम दिया गया है। बीटीई वर्तमान तरीकों की तुलना में नमूना थ्रूपुट को 100% तक बढ़ाता है। इसके अलावा, यह श्रम और उपकरणों की लागत को कम करता है। इस काम में, बीटीई नमूनों में एक डीएनए उपज (80.25 एनजी / μL) थी जो CCPP के हैंड-चॉपिंग प्रोटोकॉल (77.84 ng / μL) के साथ तुलनीय थी। यह उपकरण और तेजी से पौधे ऊतक प्रसंस्करण प्रोटोकॉल कैलिफोर्निया में कई साइट्रस नैदानिक प्रयोगशालाओं और कार्यक्रमों को लाभान्वित कर सकता है और दुनिया भर में अन्य लकड़ी की बारहमासी फसलों के लिए ऊतक प्रसंस्करण के लिए एक मॉडल प्रणाली बन सकता है।
Introduction
साइट्रस के ग्राफ्ट-पारगम्य फ्लोएम-सीमित रोगजनकों, जैसे वायरोइड्स, वायरस और बैक्टीरिया ने दुनिया के हर साइट्रस-उत्पादक क्षेत्र में विनाशकारी महामारी और गंभीर आर्थिक नुकसान का कारण बना है। साइट्रस वाइरोइड्स एक्सोकोर्टिस और कैशेक्सिया रोगों के कारण उत्पादन कारकों को सीमित कर रहे हैं जो वे आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण साइट्रस प्रकारों में पैदा करते हैं, जैसे ट्राइफोलिएट, ट्राइफोलिएट हाइब्रिड, मंदारिन, क्लेमेंटाइन और कीनू 1,2,3। कैलिफोर्निया में, ये वाइरॉइड-संवेदनशील साइट्रस प्रकार “आसान-छीलने वालों” के बढ़ते और लाभदायक बाजार का आधार हैं, जो फलों के लिए उपभोक्ताओं की प्राथमिकता में बदलाव की प्रवृत्ति के बाद हैं जो छीलने, खंडित और बीज रहित 4,5,6 हैं। इस प्रकार, साइट्रस वाइरोइड्स को कैलिफोर्निया खाद्य और कृषि विभाग (सीडीएफए) “साइट्रस नर्सरी स्टॉक कीट स्वच्छता कार्यक्रम-सीनेट बिल 140” के तहत विनियमित किया जाता है, और सीडीएफए की प्लांट पेस्ट डायग्नोस्टिक्स शाखा की प्रयोगशालाएं सालाना 7,8,9,10 हजारों साइट्रस वायरॉइड परीक्षण करती हैं।. साइट्रस ट्राइस्टेजा वायरस (सीटीवी) 1930के दशक में वैश्विक महामारी की शुरुआत के बाद से 100 मिलियन से अधिक खट्टे पेड़ों की मौत के लिए जिम्मेदार रहा है। कैलिफोर्निया में, वायरस के स्टेम थूक और ट्राइफोलिएट ब्रेकिंग प्रतिरोध आइसोलेट्स 3.6 बिलियन डॉलर के कैलिफोर्निया साइट्रस उद्योग12,13,14 के लिए एक गंभीर खतरा पैदा करते हैं। नतीजतन, सीडीएफए सीटीवी को एक विनियमित वर्ग-ए संयंत्र कीट के रूप में वर्गीकृत करता है, और सेंट्रल कैलिफोर्निया ट्रिस्टेजा उन्मूलन एजेंसी (सीसीटीईए) की प्रयोगशाला हर साल15,16 व्यापक क्षेत्र सर्वेक्षण और हजारों वायरस परीक्षण करती है। जीवाणु “कैंडिडाटस लिबिबैक्टर एशियाटिकस” (सीएलएएस) और हुआंगलोंगबिंग (एचएलबी) रोग ने साइट्रस एकड़ में 40% की कमी, साइट्रस संचालन में 57% की कमी और लगभग 8,000नौकरियों के नुकसान के परिणामस्वरूप फ्लोरिडा को लगभग 9 बिलियन डॉलर का आर्थिक नुकसान होने का अनुमान है। कैलिफोर्निया में, एचएलबी के कारण साइट्रस एकड़ में काल्पनिक 20% की कमी के परिणामस्वरूप 8,200 से अधिक नौकरियों के नुकसान और राज्य के सकल घरेलू उत्पाद में आधा बिलियन डॉलर से अधिक की कमी की भविष्यवाणी की गई थी। इसलिए, साइट्रस कीट और रोग रोकथाम कार्यक्रम कैलिफोर्निया 14,17,19,20 से सीएलए के परीक्षण, पता लगाने और उन्मूलन के लिए सर्वेक्षण ों पर सालाना $ 40 मिलियन से अधिक खर्च करता है।
साइट्रस वाइरोइड्स, वायरस और बैक्टीरिया के प्रबंधन का एक प्रमुख तत्व पेड़ के उत्पादन के लिए रोगज़नक़-परीक्षण प्रचार सामग्री (यानी, बडवुड) का उपयोग है। रोगज़नक़-परीक्षण किए गए साइट्रस बडवुड का उत्पादन और रखरखाव व्यापक संगरोध कार्यक्रमों के भीतर किया जाता है जो उन्नत रोगज़नक़ उन्मूलन और पहचान तकनीक10,21 को नियोजित करते हैं। कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, रिवरसाइड में साइट्रस क्लोनल प्रोटेक्शन प्रोग्राम (सीसीपीपी) हर साल राज्य और संयुक्त राज्य अमेरिका में आयातित खट्टे किस्मों के साथ-साथ साइट्रस बडवुड स्रोत पेड़ों से हजारों बडवुड नमूनों का परीक्षण करता है, ताकि कैलिफोर्निया के साइट्रस की रक्षा की जा सके और साइट्रस10,17,22 के लिए राष्ट्रीय स्वच्छ संयंत्र नेटवर्क के कार्यों का समर्थन किया जा सके।. साइट्रस परीक्षण की बड़ी मात्रा को संभालने के लिए, उच्च-थ्रूपुट, विश्वसनीय और लागत प्रभावी रोगज़नक़ का पता लगाने वाले परख सीसीपीपी 7,10,22 जैसे कार्यक्रमों की सफलता के लिए एक मौलिक घटक हैं।
जबकि पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) जैसे आणविक-आधारित रोगज़नक़ का पता लगाने वाले परीक्षणों ने प्लांट डायग्नोस्टिक प्रयोगशालाओं में थ्रूपुट में महत्वपूर्ण वृद्धि की अनुमति दी है, हमारे अनुभव में, उच्च-थ्रूपुट प्रोटोकॉल के कार्यान्वयन में सबसे महत्वपूर्ण बाधाओं में से एक पौधे के ऊतक नमूना प्रसंस्करण चरण है। यह साइट्रस के लिए विशेष रूप से सच है क्योंकि फ्लोएम युक्त ऊतकों जैसे पत्ती पेटियोल्स और बडवुड छाल के प्रसंस्करण के लिए वर्तमान में उपलब्ध प्रोटोकॉल श्रम-गहन, समय लेने वाले हैं, और महंगे और विशेष प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता होती है। इन प्रोटोकॉल को न्यूक्लिक एसिड क्षरण 8,23,24 से बचने के लिए कम तापमान पर हाथ से काटने, तौलने, फ्रीज-सुखाने, पीसने और सेंट्रीफ्यूजेशन की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, सीसीपीपी नैदानिक प्रयोगशाला में, नमूना प्रसंस्करण में (i) हाथ काटने (6-9 नमूने / h / ऑपरेटर), (ii) फ्रीज-सुखाने (16-24 घंटे), (iii) फुफ्फुसीकरण (30-60 s), और (iv) सेंट्रीफ्यूजेशन (1-2 घंटे) शामिल हैं। इस प्रक्रिया के लिए विशेष आपूर्ति (जैसे, भारी-शुल्क सुरक्षित-लॉक ट्यूब, स्टेनलेस स्टील पीसने वाली गेंद, एडेप्टर, ब्लेड, दस्ताने) और महंगे प्रयोगशाला उपकरण (जैसे, अल्ट्रा-लो फ्रीजर, फ्रीज-ड्रायर, ऊतक पुल्वराइज़र, तरल नाइट्रोजन क्रायोस्टेशन, प्रशीतित सेंट्रीफ्यूज) के कई टुकड़ों की भी आवश्यकता होती है।
किसी भी उद्योग की तरह, उपकरण इंजीनियरिंग और प्रक्रियाओं का स्वचालन लागत को कम करने, थ्रूपुट बढ़ाने और उच्च गुणवत्ता वाले, समान उत्पाद और सेवाएं प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। साइट्रस उद्योग को कम लागत वाले ऊतक-प्रसंस्करण उपकरणों की आवश्यकता होती है जिन्हें संचालित करने के लिए न्यूनतम कौशल की आवश्यकता होती है और इस तरह, तेजी से डाउनस्ट्रीम रोगज़नक़ का पता लगाने के लिए उच्च नमूना-प्रसंस्करण क्षमता की अनुमति देने के लिए नैदानिक प्रयोगशालाओं और क्षेत्र संचालन में स्थानांतरित करना आसान होता है। प्रौद्योगिकी विकसित समाधान (टीईएस) और सीसीपीपी ने फ्लोएम-समृद्ध साइट्रस ऊतकों (यानी, बडवुड) के तेजी से प्रसंस्करण के लिए एक कम लागत वाला (यानी, विशेष प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता को समाप्त) उपकरण विकसित किया (यानी, डिजाइन और गढ़) और मान्य (यानी, साइट्रस नमूनों के साथ परीक्षण किया और मानक प्रयोगशाला प्रक्रियाओं की तुलना में) उपकरण विकसित किया, जिसका नाम बडवुड टिशू एक्सट्रैक्टर (बीटीई) है। जैसा कि चित्रा 1 में देखा गया है, बीटीई में बिजली और नियंत्रण के लिए एक आधार घटक शामिल है, साथ ही साइट्रस बडवुड के प्रसंस्करण के लिए एक हटाने योग्य कक्ष भी शामिल है। बीटीई कक्ष एक पीसने वाले पहिये से बना है जिसे विशेष रूप से साइट्रस बडवुड से फ्लोएम युक्त छाल के ऊतकों को स्ट्रिप करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। कटा हुआ छाल ऊतक एक स्लाइड पोर्ट के माध्यम से निष्कर्षण बफर युक्त सिरिंज में तेजी से बाहर निकाला जाता है, फ़िल्टर किया जाता है, और बिना किसी अतिरिक्त हैंडलिंग या तैयारी के न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और शुद्धिकरण के लिए तैयार किया जाता है (चित्रा 1)। बीटीई प्रणाली में एक पेपरलेस नमूना ट्रैकिंग एप्लिकेशन और एक एकीकृत वजन अनुप्रयोग भी शामिल है, जो वास्तविक समय में ऑनलाइन डेटाबेस में नमूना प्रसंस्करण जानकारी रिकॉर्ड करता है।
बीटीई प्रणाली ने सीसीपीपी की प्रयोगशाला नैदानिक क्षमता में 100% से अधिक की वृद्धि की है और लगातार उच्च गुणवत्ता वाले न्यूक्लिक एसिड के शुद्धिकरण और पीसीआर परख का उपयोग करके साइट्रस के ग्राफ्ट-पारगम्य रोगजनकों का डाउनस्ट्रीम पता लगाने के लिए उपयुक्त साइट्रस ऊतक अर्क का उत्पादन किया है। अधिक विशेष रूप से, बीटीई ने ऊतक प्रसंस्करण के लिए समय को प्रति नमूना 24 घंटे से ~ 3 मिनट तक कम कर दिया है, $ 60,000 से अधिक की लागत वाले प्रयोगशाला उपकरणों को बदल दिया है (चित्रा 2, चरण 2-4), और बड़े नमूना आकारों के प्रसंस्करण के लिए अनुमति दी है।
यह पेपर स्रोत पेड़ों से साइट्रस बडवुड नमूनों के साथ बीटीई उच्च-थ्रूपुट साइट्रस छाल ऊतक प्रसंस्करण, न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और रोगज़नक़ का पता लगाने के सत्यापन डेटा को प्रस्तुत करता है, जिसमें क्रमशः सीसीपीपी रुबिडौक्स संगरोध सुविधा और लिंडकोव फाउंडेशन सुविधा से सभी उपयुक्त सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण शामिल हैं। हम वर्तमान प्रयोगशाला प्रक्रिया (चित्रा 2) की तुलना में थ्रूपुट और प्रसंस्करण समय परिवर्तन भी प्रस्तुत करते हैं। इसके अलावा, यह काम साइट्रस रोगज़नक़ परीक्षण प्रयोगशालाओं के लिए एक विस्तृत, चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान करता है और दर्शाता है कि बीटीई रोगज़नक़-स्वच्छ नर्सरी स्टॉक, सर्वेक्षण और उन्मूलन कार्यक्रमों के कार्यों का समर्थन कैसे कर सकता है।
चित्र 1: बडवुड ऊतक निकालने वाला। बीटीई में बिजली और नियंत्रण के लिए एक आधार घटक शामिल है, साथ ही साइट्रस बडवुड के प्रसंस्करण के लिए एक हटाने योग्य कक्ष भी शामिल है। बीटीई कक्ष एक पीसने वाले पहिये से बना है जिसे विशेष रूप से साइट्रस बडवुड से फ्लोएम युक्त छाल के ऊतकों को स्ट्रिप करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। कटा हुआ छाल ऊतक एक स्लाइड पोर्ट के माध्यम से एक सिरिंज में तेजी से बाहर निकाला जाता है, फ़िल्टर किया जाता है, और बिना किसी अतिरिक्त हैंडलिंग या तैयारी के न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और शुद्धिकरण के लिए तैयार किया जाता है। संक्षिप्त नाम: बीटीई = बडवुड ऊतक एक्सट्रैक्टर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: पारंपरिक हाथ काटने वाली प्रयोगशाला प्रक्रिया और बीटीई प्रसंस्करण के बीच चरण-दर-चरण तुलना। बीटीई प्रसंस्करण में उच्च-थ्रूपुट साइट्रस छाल ऊतक प्रसंस्करण, न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और रोगज़नक़ का पता लगाना शामिल है। प्रत्येक चरण के लिए समय को कोष्ठक में दर्शाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Protocol
Representative Results
Discussion
एचएलबी साइट्रस रोग के आगमन के साथ, नुकसान को कम करने के लिए, साइट्रस उद्योग, नियामक एजेंसियों और नैदानिक प्रयोगशालाओं से आग्रह किया गया है कि वे रोगप्रबंधन प्रथाओं के साथ संयोजन में व्यक्तिगत …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक ों ने काहुइला लोगों को भूमि के पारंपरिक संरक्षक के रूप में स्वीकार किया जिस पर प्रयोगात्मक कार्य पूरा हुआ था। हम यूसीआर कैलिफोर्निया कृषि और खाद्य उद्यम (सीएफे) पहल के तहत इस परियोजना के लिए अनुसंधान गतिविधियों को पूरा करने के लिए प्रयोगशाला स्थान प्रदान करने के लिए कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, रिवरसाइड में प्रोफेसर नॉर्मन एलस्ट्रैंड के आभारी हैं। इस शोध को सीडीएफए – विशेष फसल ब्लॉक अनुदान कार्यक्रम (अनुदान संख्या 18-0001-055-एससी) द्वारा समर्थित किया गया था। सीआरबी परियोजना 6100 द्वारा अतिरिक्त सहायता भी प्रदान की गई थी; यूएसडीए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ फूड एंड एग्रीकल्चर, हैच प्रोजेक्ट 1020106; और नेशनल क्लीन प्लांट नेटवर्क-यूएसडीए पशु और संयंत्र स्वास्थ्य निरीक्षण सेवा (AP17PPQS&T00C118, AP18PPQS&T00C107, AP19PPQS&T00C148, और AP20PPQS&T00C049) जॉर्जियोस विडालाकिस को सम्मानित किया गया।
Materials
| 0.08" Hex Trimmer line | PowerCare | FPRO07065 | Needed to replace blades. |
| 1 Hp, 8 gal air compressor | California Air Tools | 8010 | Quickly dry chambers after rinsed |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Globe Scientific | 111558B | Store sample in after swishing with syinges |
| 10 mL Syringe Set | Technology Evolving Solutions | TE006-F1-10A-G1000-E1 | Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING – contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required – do not mix with bleach |
| 12" Ruler | Westcott | 16012 | To measure trimmer line before cutting |
| 12% Sodium Hypochlorite | Hasa | 1041 | Disinfects chambers after processing |
| -20 C Freezer | Insignia | NS-CZ70WH0 | Store sample after processing |
| 4" x 12" plastic bags | Plymor | FP20-4×12-10 | Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal |
| 6" Cotton Swab | Puritan | 806-PCL | Swab to remove clogs |
| 7 Gallon Storage Tote | HDX | 206152 | Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers |
| Air blow gun | JASTIND | JTABG103A | Directs air into the chambers at high pressure |
| Black Sharpie | Sharpie | S-19421 | Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later |
| Bottle Top Dispensor | Brand | Z627569 | Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe |
| BTE Chamber | Technology Evolving Solutions | TE002BB-A05-E1 | Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool |
| Dish Soap | Dawn | 57445CT | Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber |
| Fume hood with hepa filter | Air Science | P5-36XT-A | Fume hood with hepa filter (ASTS-030) to limit possible contamination and protect against chemical spills |
| Insulated foam shipping container | PolarTech | 261/J50C | Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected |
| Lab coat | Red Kap | KP14WH LN 46 | Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills |
| Laptop | Microsoft | Surface | Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base |
| NFC Capable Phone | Samsung | Galaxy S9 | Phone to download and use TES phone app |
| NFC clip tag | Technology Evolving Solutions | TE005-Clip-E1 | Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app |
| NFC Collar Tag | Technology Evolving Solutions | TE005-Collar-E1 | Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app |
| Nitrile Gloves | Usa Scientific | 3915-4400 | Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills |
| Noise-Reducing Earmuff | 3M | 90565-4DC-PS | Protect ears while operating air compressor and tissue processing base |
| Polyurethane Recoil Air Hose | FYPower | 510019 | Attaches air gun to compressor |
| Saftey glasses | Solidwork | SW8329-US | Protect eyes for chemical and physical hazards |
| Spray bottle | JohnBee | B08QM81BJV | Spray bleach to deconatinate surfaces |
| Tissue Extractor Base | Technology Evolving Solutions | TE001-A-E1 | System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench |
| Tissue Processing Base Weight Scale | Technology Evolving Solutions | TE003-A05-200g-01-E1 | 200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield |
| Vermiculite | EasyGoProducts | B07WQDZGRP | Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service |
| Wire Cutter | Boenfu | BOWC-06002-US | Wire cutters to cut trimmer line |
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