Automatisering av sitrusbudvedbehandling for nedstrøms patogendeteksjon gjennom instrumentteknikk

Summary

Vi konstruerte, fabrikkerte og validerte et instrument som raskt behandler floemrike bark sitrus budwood vev. Sammenlignet med dagens metoder har budwood tissue extractor (BTE) økt prøvegjennomstrømningen og redusert de nødvendige arbeids- og utstyrskostnadene.

Abstract

Graft-overførbare, floem-begrensede patogener av sitrus som virus, viroider og bakterier er ansvarlige for ødeleggende epidemier og alvorlige økonomiske tap over hele verden. For eksempel drepte sitrus tristeza-viruset over 100 millioner sitrustrær globalt, mens “Candidatus Liberibacter asiaticus” har kostet Florida 9 milliarder dollar. Bruken av patogentestet sitrus budwood for forplantning av trær er nøkkelen til forvaltningen av slike patogener. Citrus Clonal Protection Program (CCPP) ved University of California, Riverside, bruker polymerasekjedereaksjonsanalyser (PCR) for å teste tusenvis av prøver fra sitrusbudwood-kildetrær hvert år for å beskytte Californias sitrus og for å gi rene forplantningsenheter til National Clean Plant Network. En alvorlig flaskehals i molekylær påvisning av sitrusvirus og viroider med høy gjennomstrømning er behandlingstrinnet for plantevev.

Riktig vevsforberedelse er avgjørende for ekstraksjon av kvalitetsnukleinsyrer og nedstrøms bruk i PCR-analyser. Hakking av plantevev, veiing, frysetørking, sliping og sentrifugering ved lave temperaturer for å unngå nukleinsyrenedbrytning er tidkrevende og arbeidskrevende og krever dyrt og spesialisert laboratorieutstyr. Dette papiret presenterer valideringen av et spesialisert instrument konstruert for raskt å behandle floemrike barkvev fra sitrus budwood, kalt budwood tissue extractor (BTE). BTE øker prøvegjennomstrømningen med 100% sammenlignet med dagens metoder. I tillegg reduserer det arbeidskraft og kostnaden for utstyr. I dette arbeidet hadde BTE-prøvene et DNA-utbytte (80,25 ng / μL) som var sammenlignbart med CCPPs håndhakkingsprotokoll (77,84 ng / μL). Dette instrumentet og den raske plantevevsbehandlingsprotokollen kan være til nytte for flere sitrusdiagnostiske laboratorier og programmer i California og bli et modellsystem for vevsbehandling for andre treaktige flerårige avlinger over hele verden.

Introduction

Graft-overførbare floem-begrensede patogener av sitrus, som viroider, virus og bakterier, har forårsaket ødeleggende epidemier og alvorlige økonomiske tap i alle sitrusproduserende områder av verden. Sitrus viroider er begrensende produksjonsfaktorer på grunn av exocortis og kakeksi sykdommer de forårsaker i økonomisk viktige sitrustyper, som trifoliate, trifoliate hybrider, mandariner, klementiner og mandariner ^1,2,3. I California er disse viroidfølsomme sitrustypene grunnlaget for det voksende og lønnsomme markedet for “lettskrellere”, etter den skiftende trenden i forbrukernes preferanse for frukt som er lett å skrelle, segmentert og frøfri ^4,5,6. Dermed er sitrusviroider regulert under California Department of Food and Agriculture (CDFA) “Citrus Nursery Stock Pest Cleanliness Program-Senate Bill 140”, og laboratoriene til CDFAs Plant Pest Diagnostics Branch utfører tusenvis av sitrusviroidtester årlig 7,8,9,10 . Citrus tristeza virus (CTV) har vært ansvarlig for døden av over 100 millioner sitrus trær siden begynnelsen av den globale epidemien på 1930-tallet 3,9,10,11. I California utgjør stammegrop og trifoliate bruddmotstandsisolater av viruset en alvorlig trussel mot sitrusindustrien i California på 3,6 milliarder dollar^12,13,14. Følgelig klassifiserer CDFA CTV som et regulert klasse A-planteskadegjører, og laboratoriet til Central California Tristeza Eradication Agency (CCTEA) utfører omfattende feltundersøkelser og tusenvis av virustester hvert år^15,16. Bakterien “Candidatus Liberibacter asiaticus” (CLas) og huanglongbing (HLB) sykdommen anslås å ha forårsaket nær 9 milliarder dollar av økonomisk skade på Florida som følge av en 40% reduksjon av sitrus areal, en 57% reduksjon i sitrus operasjoner, og et tap på nesten 8000 arbeidsplasser^17,18. I California ble en hypotetisk 20% reduksjon i sitrus areal på grunn av HLB spådd å resultere i mer enn 8,200 tap av arbeidsplasser og en reduksjon på over en halv milliard dollar i statens bruttonasjonalprodukt. Derfor bruker Citrus Pest and Disease Prevention Program over $ 40 millioner årlig på undersøkelser for å teste, oppdage og utrydde CLas fra California^14,17,19,20.

Et sentralt element i forvaltningen av sitrusviroider, virus og bakterier er bruken av patogentestede forplantningsmaterialer (dvs. budwood) for treproduksjon. Patogentestet sitrusbudved produseres og vedlikeholdes innenfor omfattende karanteneprogrammer som bruker avanserte patogeneliminerings- og deteksjonsteknikker^10,21. Citrus Clonal Protection Program (CCPP) ved University of California, Riverside, tester tusenvis av budwood-prøver hvert år fra sitrusvarianter som nylig er importert til staten og USA, samt kildetrær til sitrusbudwood, for å beskytte Californias sitrus og støtte funksjonene til National Clean Plant Network for Citrus^10,17,22. For å håndtere det store volumet av sitrustesting, er høy gjennomstrømning, pålitelige og kostnadseffektive patogendeteksjonsanalyser en grunnleggende komponent for suksessen til programmer som CCPP ^7,10,22.

Mens molekylærbaserte patogendeteksjonsanalyser som polymerasekjedereaksjon (PCR) har tillatt betydelige økninger i gjennomstrømning i plantediagnostiske laboratorier, er vår erfaring at en av de mest kritiske flaskehalsene i implementeringen av protokoller med høy gjennomstrømning er behandlingstrinnet for plantevevsprøver. Dette gjelder spesielt for sitrus fordi de tilgjengelige protokollene for behandling av floemrike vev som bladbladblader og budwoodbark er arbeidskrevende, tidkrevende og krever dyrt og spesialisert laboratorieutstyr. Disse protokollene krever håndhugging, veiing, frysetørking, sliping og sentrifugering ved lave temperaturer for å unngå nukleinsyrenedbrytning 8,23,24. For eksempel, ved CCPPs diagnostiske laboratorium, inkluderer prøvebehandling (i) håndhakking (6-9 prøver/t/operatør), (ii) frysetørking (16-24 timer), (iii) pulverisering (30-60 s) og (iv) sentrifugering (1-2 timer). Prosessen krever også spesialiserte forsyninger (f.eks. kraftige safe-lock rør, rustfritt stål slipekuler, adaptere, kniver, hansker) og flere stykker kostbart laboratorieutstyr (f.eks. ultra-lav fryser, frysetørker, vevpulverisator, flytende nitrogenkryostasjon, nedkjølt sentrifuge).

Som i enhver bransje er utstyrsteknikk og automatisering av prosesser nøkkelen til å senke kostnadene, øke gjennomstrømningen og tilby ensartede produkter og tjenester av høy kvalitet. Sitrusindustrien trenger rimelige vevsbehandlingsinstrumenter som krever minimal ferdighet for å operere, og som sådan er enkle å overføre til diagnostiske laboratorier og feltoperasjoner for å tillate høy prøvebehandlingskapasitet for rask nedstrøms patogendeteksjon. Technology Evolving Solutions (TES) og CCPP utviklet (dvs. design og fabrikasjon) og validert (dvs. testet med sitrusprøver og sammenlignet med standard laboratorieprosedyrer) et billig (dvs. eliminert behovet for spesialisert laboratorieutstyr) instrument for rask behandling av floemrike sitrusvev (dvs. budwood), kalt budwood tissue extractor (BTE). Som vist i figur 1 inneholder BTE en basekomponent for strøm og kontroller, pluss et avtagbart kammer for behandling av sitrusbudved. BTE-kammeret består av et slipeskive som er spesielt designet for å fjerne floemrike barkvev fra sitrusknoppveden. Det strimlede barkvevet kastes raskt ut gjennom en glideport inn i en sprøyte som inneholder ekstraksjonsbuffer, filtreres og klargjøres for nukleinsyreekstraksjon og rensing uten ytterligere håndtering eller klargjøring (figur 1). BTE-systemet inkluderer også en papirløs prøvesporingsapplikasjon og en integrert veieapplikasjon som registrerer prøvebehandlingsinformasjonen i en online database i sanntid.

BTE-systemet har økt CCPPs laboratoriediagnostiske kapasitet med over 100% og har konsekvent produsert sitrusvevekstrakter egnet for rensing av nukleinsyrer av høy kvalitet og nedstrøms påvisning av transplantatoverførbare patogener av sitrus ved hjelp av PCR-analyser. Mer spesifikt har BTE redusert tiden for vevsbehandling fra over 24 timer til ~ 3 minutter per prøve, erstattet laboratorieinstrumenter som koster over $ 60 000 (figur 2, trinn 2-4), og tillatt behandling av større prøvestørrelser.

Dette papiret presenterer BTE høy gjennomstrømning sitrus bark vev behandling, nukleinsyre ekstraksjon, og patogen deteksjon validering data med sitrus budwood prøver fra kilde trær, inkludert alle relevante positive og negative kontroller fra CCPP Rubidoux Quarantine Facility og Lindcove Foundation Facility, henholdsvis. Vi presenterer også endringer i gjennomstrømning og behandlingstid sammenlignet med dagens laboratorieprosedyre (figur 2). I tillegg gir dette arbeidet en detaljert, trinnvis protokoll for testlaboratorier for sitruspatogener og demonstrerer hvordan BTE kan støtte funksjonene til patogen-ren barnehagelager, undersøkelse og utryddelsesprogrammer.

Figur 1: Budwood vev extractor. BTE inneholder en basekomponent for strøm og kontroller, pluss et flyttbart kammer for behandling av sitrusbudved. BTE-kammeret består av et slipeskive som er spesielt designet for å stripe det floemrike barkvevet fra sitrusknopp. Det strimlede barkvevet kastes raskt ut gjennom en glideport i en sprøyte, filtreres og gjøres klar for nukleinsyreekstraksjon og rensing uten ytterligere håndtering eller forberedelse. Forkortelse: BTE = budwood vev extractor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Trinnvis sammenligning mellom den konvensjonelle laboratorieprosedyren for håndhakking og BTE-behandling. BTE-behandling innebærer behandling av sitrusbarkvev med høy gjennomstrømning, nukleinsyreekstraksjon og patogendeteksjon. Tiden for hvert trinn er angitt i parentes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

1. Innsamling av sitrusbudvedprøver for å sende Send Technology Evolving Solutions et regneark med treinformasjon som de kan laste inn på webserveren (til slutt vil brukeren opprette nye trær). Bruk telefonappen TES-tracker til å velge et tre, og hold en NFC-kragekode (nærfeltskommunikasjon) til telefonen for å laste treinformasjonen til taggen. Sett inn tre til fire sitrusbudvedprøver i den BTE-kompatible plastposeholderen, og lukk med lokket.<l…

Representative Results

RNA-ekstraksjon, rensing og kvalitet ved bruk av BTE-behandlet budwood sitrusvev og vurdering av tid for vevsbehandlingVi brukte budwood-prøver fra 255 representative sitrustrær for denne testen for å sammenligne RNA-kvaliteten fra BTE mot standardprosedyren. Prøvene ble behandlet av budwood tissue extractor (BTE) (protokolltrinn 4.1-4.6 og figur 2, høyre side, trinn 1, trinn 5 og trinn 6) eller utarbeidet etter den regulatorisk godkjente behandlingsmetoden for sitrusknopptre, som bruker håndpe…

Discussion

Med fremkomsten av HLB sitrussykdom, for å redusere tap, har sitrusindustrien, reguleringsorganer og diagnostiske laboratorier blitt oppfordret til å stole på nukleinsyreekstraksjonsmetoder med høy gjennomstrømning kombinert med manuell prøvebehandling med lav gjennomstrømning og patogendeteksjonsanalyser som qPCR³⁴ for testing av individuelle trær, i kombinasjon med sykdomshåndteringspraksis³⁵. Californias HLB-positivitetsrate har gått fra 0.01% i 2012 til 1.2% i…

Materials

0.08" Hex Trimmer line	PowerCare	FPRO07065	Needed to replace blades.
1 Hp, 8 gal air compressor	California Air Tools	8010	Quickly dry chambers after rinsed
1.5 mL microcentrifuge tube	Globe Scientific	111558B	Store sample in after swishing with syinges
10 mL Syringe Set	Technology Evolving Solutions	TE006-F1-10A-G1000-E1	Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING – contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required – do not mix with bleach
12" Ruler	Westcott	‎16012	To measure trimmer line before cutting
12% Sodium Hypochlorite	Hasa	1041	Disinfects chambers after processing
-20 C Freezer	Insignia	NS-CZ70WH0	Store sample after processing
4" x 12" plastic bags	Plymor	FP20-4×12-10	Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal
6" Cotton Swab	Puritan	806-PCL	Swab to remove clogs
7 Gallon Storage Tote	HDX	206152	Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers
Air blow gun	JASTIND	‎JTABG103A	Directs air into the chambers at high pressure
Black Sharpie	Sharpie	S-19421	Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later
Bottle Top Dispensor	Brand	Z627569	Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe
BTE Chamber	Technology Evolving Solutions	TE002BB-A05-E1	Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool
Dish Soap	Dawn	57445CT	Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber
Fume hood with hepa filter	Air Science	P5-36XT-A	Fume hood with hepa filter (ASTS-030)  to limit possible contamination and protect against chemical spills
Insulated foam shipping container	PolarTech	261/J50C	Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected
Lab coat	Red Kap	KP14WH LN 46	Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills
Laptop	Microsoft	Surface	Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base
NFC Capable Phone	Samsung	Galaxy S9	Phone to download and use TES phone app
NFC clip tag	Technology Evolving Solutions	TE005-Clip-E1	Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app
NFC Collar Tag	Technology Evolving Solutions	TE005-Collar-E1	Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app
Nitrile Gloves	Usa Scientific	3915-4400	Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills
Noise-Reducing Earmuff	3M	90565-4DC-PS	Protect ears while operating air compressor and tissue processing base
Polyurethane Recoil Air Hose	FYPower	‎510019	Attaches air gun to compressor
Saftey glasses	Solidwork	SW8329-US	Protect eyes for chemical and physical hazards
Spray bottle	JohnBee	B08QM81BJV	Spray bleach to deconatinate surfaces
Tissue Extractor Base	Technology Evolving Solutions	TE001-A-E1	System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench
Tissue Processing Base Weight Scale	Technology Evolving Solutions	TE003-A05-200g-01-E1	200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield
Vermiculite	EasyGoProducts	B07WQDZGRP	Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service
Wire Cutter	Boenfu	‎BOWC-06002-US	Wire cutters to cut trimmer line