Automatización del procesamiento de yemas de cítricos para la detección de patógenos posteriores a través de la ingeniería de instrumentos

Summary

Diseñamos, fabricamos y validamos un instrumento que procesa rápidamente tejidos de yemas cítricas de corteza ricos en floema. En comparación con los métodos actuales, el extractor de tejido de yemas (BTE) ha aumentado el rendimiento de las muestras y ha disminuido los costes de mano de obra y equipos necesarios.

Abstract

Los patógenos de los cítricos transmisibles y limitados por el floema, como los virus, los viroides y las bacterias, son responsables de epidemias devastadoras y graves pérdidas económicas en todo el mundo. Por ejemplo, el virus de la tristeza de los cítricos mató a más de 100 millones de árboles de cítricos en todo el mundo, mientras que el “Candidatus Liberibacter asiaticus” le ha costado a Florida $ 9 mil millones. El uso de yemas de cítricos sometidas a pruebas de patógenos para la propagación de árboles es clave para el manejo de dichos patógenos. El Programa de Protección Clonal de Cítricos (CCPP, por sus siglas en inglés) de la Universidad de California, Riverside, utiliza ensayos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) para analizar miles de muestras de árboles fuente de yemas de cítricos cada año para proteger los cítricos de California y proporcionar unidades de propagación limpia a la Red Nacional de Plantas Limpias. Un grave cuello de botella en la detección molecular de alto rendimiento de virus y viroides cítricos es el paso de procesamiento de tejidos vegetales.

La preparación adecuada de los tejidos es fundamental para la extracción de ácidos nucleicos de calidad y su uso posterior en los ensayos de PCR. El picado, pesaje, liofilización, molienda y centrifugación de tejidos vegetales a bajas temperaturas para evitar la degradación de ácidos nucleicos requiere mucho tiempo y mano de obra y requiere equipos de laboratorio costosos y especializados. Este artículo presenta la validación de un instrumento especializado diseñado para procesar rápidamente tejidos de corteza ricos en floema a partir de yemas de cítricos, denominado extractor de tejido de yemas (BTE). El BTE aumenta el rendimiento de las muestras en un 100% en comparación con los métodos actuales. Además, disminuye la mano de obra y el costo del equipo. En este trabajo, las muestras de BTE tuvieron un rendimiento de ADN (80,25 ng/μL) que fue comparable con el protocolo de corte manual del CCPP (77,84 ng/μL). Este instrumento y el protocolo de procesamiento rápido de tejidos vegetales pueden beneficiar a varios laboratorios y programas de diagnóstico de cítricos en California y convertirse en un sistema modelo para el procesamiento de tejidos para otros cultivos leñosos perennes en todo el mundo.

Introduction

Los patógenos de los cítricos limitados por floema transmisibles por injerto, como los viroides, los virus y las bacterias, han causado epidemias devastadoras y graves pérdidas económicas en todas las zonas productoras de cítricos del mundo. Los viroides de los cítricos son factores limitantes de la producción debido a las enfermedades de exocortis y caquexia que causan en los tipos de cítricos económicamente importantes, como los trifoliados, los híbridos trifoliados, las mandarinas, las clementinas y las mandarinas ^1,2,3. En California, estos tipos de cítricos sensibles a los viroides son la base del creciente y rentable mercado de los “peladores fáciles”, siguiendo la tendencia cambiante en la preferencia de los consumidores por frutas fáciles de pelar, segmentadas y sin semillas ^4,5,6. Por lo tanto, los viroides de los cítricos están regulados por el Departamento de Alimentos y Agricultura de California (CDFA, por sus siglas en inglés) “Programa de Limpieza de Plagas de Plantas de Vivero-Proyecto de Ley del Senado 140”, y los laboratorios de la División de Diagnóstico de Plagas de Plantas del CDFA realizan miles de pruebas de viroides de cítricos anualmente 7,8,9,10 . El virus de la tristeza de los cítricos (CTV) ha sido responsable de la muerte de más de 100 millones de árboles de cítricos desde el comienzo de la epidemia mundial en la década de 1930 3,9,10,11. En California, los aislados del virus de la resistencia a la rotura del tallo y a la rotura trifoliada representan una seria amenaza para la industria de cítricos de California de $3.6 mil millones^12,13,14. En consecuencia, el CDFA clasifica al CTV como una plaga vegetal de clase A regulada, y el laboratorio de la Agencia de Erradicación de la Tristeza de California Central (CCTEA, por sus siglas en inglés) realiza extensos estudios de campo y miles de pruebas de virus cada año^15,16. Se estima que la bacteria “Candidatus Liberibacter asiaticus” (CLas) y la enfermedad huanglongbing (HLB) han causado cerca de $9 mil millones de daños económicos a Florida como resultado de una reducción del 40% de la superficie de cítricos, una disminución del 57% en las operaciones de cítricos y una pérdida de casi 8,000^{puestos de} trabajo. En California, se predijo que una hipotética reducción del 20% en la superficie de cítricos debido al HLB resultaría en la pérdida de más de 8,200 empleos y una reducción de más de 500 millones de dólares en el producto interno bruto del estado. Por lo tanto, el Programa de Prevención de Plagas y Enfermedades de los Cítricos gasta más de $40 millones anuales en encuestas para analizar, detectar y erradicar las CLas de California^14,17,19,20.

Un elemento clave del manejo de viroides, virus y bacterias de los cítricos es el uso de materiales propagativos probados contra patógenos (es decir, yemas) para la producción de árboles. Las yemas de los cítricos sometidas a pruebas de patógenos se producen y mantienen en el marco de programas de cuarentena integrales que emplean técnicas avanzadas de eliminación y detección de patógenos^10,21. El Programa de Protección Clonal de Cítricos (CCPP, por sus siglas en inglés) de la Universidad de California, Riverside, analiza miles de muestras de yemas cada año de variedades de cítricos recién importadas al estado y a los EE. UU., así como árboles fuente de yemas de cítricos, para proteger los cítricos de California y apoyar las funciones de la Red Nacional de Plantas Limpias para Cítricos^10,17,22. Para manejar el gran volumen de pruebas de cítricos, los ensayos de detección de patógenos de alto rendimiento, confiables y rentables son un componente fundamental para el éxito de programas como el CCPP ^7,10,22.

Si bien los ensayos de detección de patógenos basados en moléculas, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), han permitido aumentos significativos en el rendimiento en los laboratorios de diagnóstico de plantas, en nuestra experiencia, uno de los cuellos de botella más críticos en la implementación de protocolos de alto rendimiento es el paso de procesamiento de muestras de tejido vegetal. Esto es particularmente cierto en el caso de los cítricos porque los protocolos disponibles actualmente para el procesamiento de tejidos ricos en floema, como los pecíolos de las hojas y la corteza de las yemas, requieren mucha mano de obra, mucho tiempo y equipos de laboratorio costosos y especializados. Estos protocolos requieren picado manual, pesaje, liofilización, molienda y centrifugación a bajas temperaturas para evitar la degradación de ácidos nucleicos 8,23,24. Por ejemplo, en el laboratorio de diagnóstico del CCPP, el procesamiento de muestras incluye (i) picado manual (6-9 muestras/h/operador), (ii) liofilización (16-24 h), (iii) pulverización (30-60 s) y (iv) centrifugación (1-2 h). El proceso también requiere suministros especializados (p. ej., tubos de seguridad de alta resistencia, bolas de molienda de acero inoxidable, adaptadores, cuchillas, guantes) y múltiples piezas de equipo de laboratorio costoso (p. ej., congelador ultrabajo, liofilizador, pulverizador de tejidos, crioestación de nitrógeno líquido, centrífuga refrigerada).

Como en cualquier industria, la ingeniería de equipos y la automatización de procesos son clave para reducir costos, aumentar el rendimiento y proporcionar productos y servicios uniformes y de alta calidad. La industria de los cítricos necesita instrumentos de procesamiento de tejidos de bajo costo que requieran una habilidad mínima para operar y, como tales, sean fáciles de transferir a los laboratorios de diagnóstico y a las operaciones de campo para permitir una alta capacidad de procesamiento de muestras para la rápida detección de patógenos aguas abajo. Technology Evolving Solutions (TES) y el CCPP desarrollaron (es decir, diseñaron y fabricaron) y validaron (es decir, probaron con muestras de cítricos y compararon con procedimientos de laboratorio estándar) un instrumento de bajo costo (es decir, eliminaron la necesidad de equipos de laboratorio especializados) para el procesamiento rápido de tejidos cítricos ricos en floema (es decir, yemas), llamado extractor de tejidos de yemas (BTE). Como se ve en la Figura 1, el BTE incluye un componente base para la potencia y los controles, además de una cámara extraíble para el procesamiento de las yemas de los cítricos. La cámara BTE está compuesta por una muela abrasiva diseñada específicamente para eliminar los tejidos de la corteza ricos en floema de las yemas de los cítricos. El tejido de la corteza triturada se expulsa rápidamente a través de un puerto deslizante a una jeringa que contiene tampón de extracción, se filtra y se prepara para la extracción y purificación de ácidos nucleicos sin ninguna manipulación o preparación adicional (Figura 1). El sistema BTE también incluye una aplicación de seguimiento de muestras sin papel y una aplicación de pesaje integrada, que registran la información de procesamiento de muestras en una base de datos en línea en tiempo real.

El sistema BTE ha aumentado la capacidad de diagnóstico de laboratorio del CCPP en más del 100% y ha producido sistemáticamente extractos de tejidos cítricos adecuados para la purificación de ácidos nucleicos de alta calidad y la detección posterior de patógenos de cítricos transmisibles por injerto mediante ensayos de PCR. Más específicamente, BTE ha reducido el tiempo de procesamiento de tejidos de más de 24 h a ~3 min por muestra, ha reemplazado instrumentos de laboratorio que cuestan más de $ 60,000 (Figura 2, pasos 2-4) y ha permitido el procesamiento de tamaños de muestra más grandes.

Este artículo presenta los datos de validación del procesamiento de tejidos de corteza de cítricos de alto rendimiento de BTE, la extracción de ácidos nucleicos y la detección de patógenos con muestras de yemas de cítricos de árboles fuente, incluidos todos los controles positivos y negativos apropiados de la Instalación de Cuarentena CCPP Rubidoux y la Instalación de la Fundación Lindcove, respectivamente. También presentamos los cambios en el rendimiento y el tiempo de procesamiento en comparación con el procedimiento de laboratorio actual (Figura 2). Además, este trabajo proporciona un protocolo detallado, paso a paso, para los laboratorios de pruebas de patógenos de cítricos y demuestra cómo el BTE puede apoyar las funciones de los programas de reproductores, encuestas y erradicación de plantas de cría de patógenos limpios.

Figura 1: Extractor de tejido de yemas. El BTE incluye un componente base para la potencia y los controles, además de una cámara extraíble para el procesamiento de las yemas de los cítricos. La cámara BTE está compuesta por una muela abrasiva diseñada específicamente para eliminar los tejidos de la corteza ricos en floema de las yemas de los cítricos. El tejido de la corteza triturada se expulsa rápidamente a través de un puerto deslizante a una jeringa, se filtra y se prepara para la extracción y purificación de ácidos nucleicos sin ninguna manipulación o preparación adicional. Abreviatura: BTE = extractor de tejidos de yemas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Comparación paso a paso entre el procedimiento convencional de laboratorio de corte manual y el procesamiento de BTE. El procesamiento de BTE implica el procesamiento de tejidos de corteza de cítricos de alto rendimiento, la extracción de ácidos nucleicos y la detección de patógenos. El tiempo de cada paso se indica entre paréntesis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

1. Recolección de las muestras de yemas de cítricos para enviar Envíe a Technology Evolving Solutions una hoja de cálculo de información de árboles para que la carguen en su servidor web (eventualmente, el usuario creará nuevos árboles). Use el rastreador TES de la aplicación de teléfono para seleccionar un árbol y sostenga una etiqueta de collar de comunicación de campo cercano (NFC) en el teléfono para cargar la información del árbol en la etiqueta.</…

Representative Results

Extracción, purificación y calidad del ARN utilizando tejido cítrico de yema procesado con BTE y evaluación del tiempo de procesamiento del tejidoUtilizamos muestras de yemas de 255 árboles de cítricos representativos para esta prueba con el fin de comparar la calidad del ARN del BTE con el procedimiento estándar. Las muestras se procesaron con el extractor de tejido de yemas (BTE) (pasos del protocolo 4.1-4.6 y Figura 2, lado derecho, paso 1, paso 5 y paso 6) o se prepararon siguiendo el mét…

Discussion

Con el advenimiento de la enfermedad de los cítricos HLB, para reducir las pérdidas, se ha instado a la industria de los cítricos, las agencias reguladoras y los laboratorios de diagnóstico a confiar en métodos de extracción de ácidos nucleicos de alto rendimiento combinados con el procesamiento manual de muestras de bajo rendimiento y ensayos de detección de patógenos como qPCR³⁴ para el análisis de árboles individuales, en combinación con prácticas de manejo de enfermedades<sup clas…

Materials

0.08" Hex Trimmer line	PowerCare	FPRO07065	Needed to replace blades.
1 Hp, 8 gal air compressor	California Air Tools	8010	Quickly dry chambers after rinsed
1.5 mL microcentrifuge tube	Globe Scientific	111558B	Store sample in after swishing with syinges
10 mL Syringe Set	Technology Evolving Solutions	TE006-F1-10A-G1000-E1	Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING – contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required – do not mix with bleach
12" Ruler	Westcott	‎16012	To measure trimmer line before cutting
12% Sodium Hypochlorite	Hasa	1041	Disinfects chambers after processing
-20 C Freezer	Insignia	NS-CZ70WH0	Store sample after processing
4" x 12" plastic bags	Plymor	FP20-4×12-10	Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal
6" Cotton Swab	Puritan	806-PCL	Swab to remove clogs
7 Gallon Storage Tote	HDX	206152	Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers
Air blow gun	JASTIND	‎JTABG103A	Directs air into the chambers at high pressure
Black Sharpie	Sharpie	S-19421	Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later
Bottle Top Dispensor	Brand	Z627569	Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe
BTE Chamber	Technology Evolving Solutions	TE002BB-A05-E1	Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool
Dish Soap	Dawn	57445CT	Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber
Fume hood with hepa filter	Air Science	P5-36XT-A	Fume hood with hepa filter (ASTS-030)  to limit possible contamination and protect against chemical spills
Insulated foam shipping container	PolarTech	261/J50C	Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected
Lab coat	Red Kap	KP14WH LN 46	Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills
Laptop	Microsoft	Surface	Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base
NFC Capable Phone	Samsung	Galaxy S9	Phone to download and use TES phone app
NFC clip tag	Technology Evolving Solutions	TE005-Clip-E1	Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app
NFC Collar Tag	Technology Evolving Solutions	TE005-Collar-E1	Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app
Nitrile Gloves	Usa Scientific	3915-4400	Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills
Noise-Reducing Earmuff	3M	90565-4DC-PS	Protect ears while operating air compressor and tissue processing base
Polyurethane Recoil Air Hose	FYPower	‎510019	Attaches air gun to compressor
Saftey glasses	Solidwork	SW8329-US	Protect eyes for chemical and physical hazards
Spray bottle	JohnBee	B08QM81BJV	Spray bleach to deconatinate surfaces
Tissue Extractor Base	Technology Evolving Solutions	TE001-A-E1	System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench
Tissue Processing Base Weight Scale	Technology Evolving Solutions	TE003-A05-200g-01-E1	200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield
Vermiculite	EasyGoProducts	B07WQDZGRP	Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service
Wire Cutter	Boenfu	‎BOWC-06002-US	Wire cutters to cut trimmer line