Narenciye tomurcuk ağacı işlemenin, cihaz mühendisliği yoluyla aşağı akış patojen tespiti için otomatikleştirilmesi
Summary
Floem bakımından zengin kabuklu narenciye tomurcuk ağacı dokularını hızla işleyen bir alet tasarladık, ürettik ve onayladık. Mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında, tomurcuk ağacı doku çıkarıcısı (BTE), numune verimini artırdı ve gerekli işçilik ve ekipman maliyetlerini azalttı.
Abstract
Virüsler, viroidler ve bakteriler gibi narenciyenin greftle bulaşabilen, floemle sınırlı patojenleri, dünya çapında yıkıcı salgınlardan ve ciddi ekonomik kayıplardan sorumludur. Örneğin, narenciye tristeza virüsü dünya çapında 100 milyondan fazla narenciye ağacını öldürürken, “Candidatus Liberibacter asiaticus” Florida’ya 9 milyar dolara mal oldu. Ağaç yayılımı için patojen testi yapılmış narenciye tomurcuk ağacının kullanılması, bu tür patojenlerin yönetimi için anahtardır. Riverside, California Üniversitesi’ndeki Narenciye Klonal Koruma Programı (CCPP), Kaliforniya’nın narenciyesini korumak ve Ulusal Temiz Bitki Ağı’na temiz çoğaltma üniteleri sağlamak için her yıl narenciye tomurcuk ağacı kaynak ağaçlarından binlerce numuneyi test etmek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tahlillerini kullanır. Narenciye virüslerinin ve viroidlerinin yüksek verimli moleküler tespitinde ciddi bir darboğaz, bitki dokusu işleme adımıdır.
Uygun doku hazırlığı, kaliteli nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve PCR tahlillerinde aşağı akış kullanımı için kritik öneme sahiptir. Nükleik asit bozulmasını önlemek için düşük sıcaklıklarda bitki dokusu doğrama, tartma, dondurarak kurutma, öğütme ve santrifüjleme zaman yoğun ve emek yoğundur ve pahalı ve özel laboratuvar ekipmanı gerektirir. Bu makale, tomurcuk ağacı dokusu çıkarıcı (BTE) olarak adlandırılan, turunçgil tomurcuk ağacından floem bakımından zengin kabuk dokularını hızlı bir şekilde işlemek için tasarlanmış özel bir aletin doğrulanmasını sunmaktadır. BTE, mevcut yöntemlere kıyasla numune verimini %100 artırır. Ek olarak, işçiliği ve ekipman maliyetini azaltır. Bu çalışmada, BTE örnekleri, CCPP’nin elle doğrama protokolü (77.84 ng/μL) ile karşılaştırılabilir bir DNA verimine (80.25 ng/μL) sahipti. Bu cihaz ve hızlı bitki doku işleme protokolü, Kaliforniya’daki çeşitli narenciye teşhis laboratuvarlarına ve programlarına fayda sağlayabilir ve dünya çapındaki diğer odunsu çok yıllık mahsuller için doku işleme için model bir sistem haline gelebilir.
Introduction
Viroidler, virüsler ve bakteriler gibi narenciyenin greftle bulaşabilen floemle sınırlı patojenleri, dünyanın narenciye üreten her bölgesinde yıkıcı salgınlara ve ciddi ekonomik kayıplara neden olmuştur. Turunçgil viroidleri, trifoliat, trifoliat melezleri, mandalina, clementine ve mandalinagibi ekonomik açıdan önemli turunçgil türlerinde neden oldukları ekzokortis ve kaşeksi hastalıkları nedeniyle üretim faktörlerini sınırlamaktadır 1,2,3. Kaliforniya’da, bu viroide duyarlı narenciye türleri, tüketicilerin soyulması kolay, dilimlenmiş ve çekirdeksiz meyvelere yönelik tercihlerindeki değişen eğilimi takiben, büyüyen ve karlı “kolay soyulanlar” pazarının temelidir 4,5,6. Bu nedenle, narenciye viroidleri Kaliforniya Gıda ve Tarım Bakanlığı (CDFA) “Narenciye Fidanlığı Stok Haşere Temizleme Programı-Senato Yasa Tasarısı 140” kapsamında düzenlenmektedir ve CDFA’nın Bitki Zararlıları Teşhis Şubesi laboratuvarları yılda binlerce narenciye viroid testi gerçekleştirmektedir 7,8,9,10 . Narenciye tristeza virüsü (CTV), 1930’larda küresel salgının başlangıcından bu yana 100 milyondan fazla narenciye ağacının ölümünden sorumlu olmuştur 3,9,10,11. Kaliforniya’da, virüsün kök çukurlaşması ve üç yapraklı kırılma direnci izolatları, 3,6 milyar dolarlık Kaliforniya narenciye endüstrisi için ciddi bir tehdit oluşturuyor12,13,14. Sonuç olarak, CDFA, CTV’yi düzenlenmiş bir A sınıfı bitki zararlısı olarak sınıflandırır ve Orta Kaliforniya Tristeza Eradikasyon Ajansı’nın (CCTEA) laboratuvarı her yıl kapsamlı saha araştırmaları ve binlerce virüs testi gerçekleştirir15,16. “Candidatus Liberibacter asiaticus” (CLas) bakterisi ve huanglongbing (HLB) hastalığının, narenciye ekim alanlarında% 40’lık bir azalma, narenciye operasyonlarında% 57’lik bir azalma ve yaklaşık 8.000 iş kaybı sonucunda Florida’da 9 milyar dolara yakın ekonomik hasara neden olduğu tahmin edilmektedir17,18. Kaliforniya’da, HLB nedeniyle narenciye alanında varsayımsal %20’lik bir azalmanın 8.200’den fazla iş kaybına ve eyaletin gayri safi yurtiçi hasılasında yarım milyar doların üzerinde bir azalmaya neden olacağı tahmin ediliyordu. Bu nedenle, Narenciye Zararlıları ve Hastalıklarını Önleme Programı, Kaliforniya14,17,19,20’den CLas’ı test etmek, tespit etmek ve ortadan kaldırmak için yapılan anketlere yılda 40 milyon doların üzerinde harcama yapmaktadır.
Narenciye viroidlerinin, virüslerin ve bakterilerin yönetiminin önemli bir unsuru, ağaç üretimi için patojen testi yapılmış çoğaltma malzemelerinin (yani tomurcuk ağacı) kullanılmasıdır. Patojen testi yapılmış narenciye tomurcuk ağacı, gelişmiş patojen eliminasyon ve tespit tekniklerini kullanan kapsamlı karantina programları kapsamında üretilir ve bakımı yapılır10,21. Riverside, California Üniversitesi’ndeki Narenciye Klonal Koruma Programı (CCPP), Kaliforniya’nın narenciyesini korumak ve Narenciye için Ulusal Temiz Bitki Ağı’nın işlevlerini desteklemek için her yıl eyalete ve ABD’ye yeni ithal edilen narenciye çeşitlerinden ve narenciye tomurcuk ağacı kaynak ağaçlarından binlerce tomurcuk ağacı örneğini test ediyor10,17,22. Büyük hacimli narenciye testinin üstesinden gelmek için, yüksek verimli, güvenilir ve uygun maliyetli patojen tespit testleri, CCPP 7,10,22 gibi programların başarısı için temel bir bileşendir.
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gibi moleküler bazlı patojen tespit testleri, bitki teşhis laboratuvarlarında verimde önemli artışlara izin verirken, deneyimlerimize göre, yüksek verimli protokollerin uygulanmasındaki en kritik darboğazlardan biri bitki doku numunesi işleme adımıdır. Bu özellikle narenciye için geçerlidir, çünkü yaprak sapları ve tomurcuk ağacı kabuğu gibi floem bakımından zengin dokuların işlenmesi için şu anda mevcut olan protokoller emek yoğundur, zaman alıcıdır ve pahalı ve özel laboratuvar ekipmanı gerektirir. Bu protokoller, nükleik asit bozulmasını önlemek için düşük sıcaklıklarda elle doğrama, tartma, dondurarak kurutma, öğütme ve santrifüjleme gerektirir 8,23,24. Örneğin, CCPP tanı laboratuvarında numune işleme, (i) elle doğrama (6-9 numune/saat/operatör), (ii) dondurarak kurutma (16-24 saat), (iii) toz haline getirme (30-60 saat) ve (iv) santrifüjlemeyi (1-2 saat) içerir. Süreç ayrıca özel sarf malzemeleri (örneğin, ağır hizmet tipi güvenli kilitli borular, paslanmaz çelik taşlama bilyaları, adaptörler, bıçaklar, eldivenler) ve çok sayıda maliyetli laboratuvar ekipmanı (örneğin, ultra düşük dondurucu, dondurarak kurutucu, doku pulverizatör, sıvı nitrojen kriyo istasyonu, soğutmalı santrifüj) gerektirir.
Her sektörde olduğu gibi, ekipman mühendisliği ve süreçlerin otomasyonu, maliyetleri düşürmenin, verimi artırmanın ve yüksek kaliteli, tek tip ürün ve hizmetler sunmanın anahtarıdır. Narenciye endüstrisi, çalıştırmak için minimum beceri gerektiren düşük maliyetli doku işleme cihazlarına ihtiyaç duyar ve bu nedenle, hızlı aşağı akış patojen tespiti için yüksek numune işleme kapasitesine izin vermek için teşhis laboratuvarlarına ve saha operasyonlarına aktarılması kolaydır. Teknoloji Gelişen Çözümler (TES) ve CCPP, floem bakımından zengin narenciye dokularının (yani tomurcuk ağacı) hızlı işlenmesi için düşük maliyetli (yani özel laboratuvar ekipmanına olan ihtiyacı ortadan kaldıran) bir cihaz geliştirdi (yani tasarladı ve üretti) ve doğruladı (yani, narenciye numuneleriyle test edildi ve standart laboratuvar prosedürleriyle karşılaştırıldı), tomurcuk ağacı doku çıkarıcı (BTE) olarak adlandırıldı. Şekil 1’de görüldüğü gibi, BTE, güç ve kontroller için bir temel bileşenin yanı sıra narenciye tomurcuk ağacının işlenmesi için çıkarılabilir bir oda içerir. BTE odası, floem bakımından zengin kabuk dokularını narenciye tomurcuk ağacından sıyırmak için özel olarak tasarlanmış bir öğütme çarkından oluşur. Parçalanmış kabuk dokusu, bir slayt portundan ekstraksiyon tamponu içeren bir şırıngaya hızla çıkarılır, süzülür ve herhangi bir ek işlem veya hazırlık olmaksızın nükleik asit ekstraksiyonu ve saflaştırması için hazır hale getirilir (Şekil 1). BTE sistemi ayrıca, numune işleme bilgilerini gerçek zamanlı olarak çevrimiçi bir veritabanına kaydeden kağıtsız bir numune izleme uygulaması ve entegre bir tartım uygulaması içerir.
BTE sistemi, CCPP’nin laboratuvar teşhis kapasitesini %100’ün üzerinde artırdı ve sürekli olarak yüksek kaliteli nükleik asitlerin saflaştırılması ve PCR tahlilleri kullanılarak narenciyenin greftle bulaşan patojenlerinin aşağı yönde tespiti için uygun narenciye dokusu ekstraktları üretti. Daha spesifik olarak, BTE, doku işleme süresini numune başına 24 saatten ~3 dakikaya düşürdü, maliyeti 60.000 doların üzerinde olan laboratuvar cihazlarının yerini aldı (Şekil 2, adım 2-4) ve daha büyük numune boyutlarının işlenmesine izin verdi.
Bu makale, sırasıyla CCPP Rubidoux Karantina Tesisi ve Lindcove Vakfı Tesisi’nden alınan tüm uygun pozitif ve negatif kontroller dahil olmak üzere, kaynak ağaçlardan alınan narenciye tomurcuk ağacı örnekleriyle BTE yüksek verimli narenciye kabuğu doku işleme, nükleik asit ekstraksiyonu ve patojen tespit doğrulama verilerini sunmaktadır. Ayrıca, mevcut laboratuvar prosedürüne kıyasla verim ve işlem süresi değişikliklerini de sunuyoruz (Şekil 2). Ek olarak, bu çalışma narenciye patojen test laboratuvarları için ayrıntılı, adım adım bir protokol sağlar ve BTE’nin patojen temizliği yapan fidanlık stoğu, araştırma ve eradikasyon programlarının işlevlerini nasıl destekleyebileceğini gösterir.
Şekil 1: Tomurcuk ağacı doku çıkarıcısı. BTE, güç ve kontroller için bir temel bileşenin yanı sıra narenciye tomurcuk ağacının işlenmesi için çıkarılabilir bir bölme içerir. BTE odası, floem bakımından zengin kabuk dokularını narenciye tomurcuk ağacından sıyırmak için özel olarak tasarlanmış bir öğütme çarkından oluşur. Parçalanmış kabuk dokusu, bir slayt portundan bir şırıngaya hızla çıkarılır, süzülür ve herhangi bir ek işlem veya hazırlık olmaksızın nükleik asit ekstraksiyonu ve saflaştırması için hazır hale getirilir. Kısaltma: BTE = tomurcuk ağacı doku çıkarıcı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Konvansiyonel elle doğrama laboratuvarı prosedürü ile BTE prosesi arasında adım adım karşılaştırma. BTE işleme, yüksek verimli narenciye kabuğu dokusu işleme, nükleik asit ekstraksiyonu ve patojen tespitini içerir. Her adımın zamanı parantez içinde belirtilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Protocol
Representative Results
Discussion
HLB narenciye hastalığının ortaya çıkmasıyla birlikte, kayıpları azaltmak için narenciye endüstrisi, düzenleyici kurumlar ve teşhis laboratuvarları, hastalık yönetimi uygulamalarıyla birlikte tek tek ağaçların test edilmesi için qPCR34 gibi düşük verimli manuel numune işleme ve patojen tespit testleri ile birlikte yüksek verimli nükleik asit ekstraksiyon yöntemlerine güvenmeye teşvik edilmiştir35. Kaliforniya’nın HLB pozitiflik oranı 2012’de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Cahuilla halkını, deneysel çalışmanın tamamlandığı Toprağın Geleneksel Koruyucuları olarak kabul ediyor. UCR California Tarım ve Gıda Girişimi (CAFÉ) Girişimi kapsamında bu proje için araştırma faaliyetlerini yürütmek üzere laboratuvar alanı sağladığı için Riverside’daki California Üniversitesi’nden Profesör Norman Ellstrand’a minnettarız. Bu araştırma, CDFA – Özel Mahsul Bloğu Hibe Programı (hibe no. 18-0001-055-SC) tarafından desteklenmiştir. CRB projesi 6100 tarafından da ek destek sağlandı; USDA Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü, Hatch projesi 1020106; ve Ulusal Temiz Bitki Ağı-USDA Hayvan ve Bitki Sağlığı Denetim Servisi (AP17PPQS&T00C118, AP18PPQS&T00C107, AP19PPQS&T00C148, & AP20PPQS&T00C049) Georgios Vidalakis’e verildi.
Materials
| 0.08" Hex Trimmer line | PowerCare | FPRO07065 | Needed to replace blades. |
| 1 Hp, 8 gal air compressor | California Air Tools | 8010 | Quickly dry chambers after rinsed |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Globe Scientific | 111558B | Store sample in after swishing with syinges |
| 10 mL Syringe Set | Technology Evolving Solutions | TE006-F1-10A-G1000-E1 | Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING – contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required – do not mix with bleach |
| 12" Ruler | Westcott | 16012 | To measure trimmer line before cutting |
| 12% Sodium Hypochlorite | Hasa | 1041 | Disinfects chambers after processing |
| -20 C Freezer | Insignia | NS-CZ70WH0 | Store sample after processing |
| 4" x 12" plastic bags | Plymor | FP20-4×12-10 | Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal |
| 6" Cotton Swab | Puritan | 806-PCL | Swab to remove clogs |
| 7 Gallon Storage Tote | HDX | 206152 | Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers |
| Air blow gun | JASTIND | JTABG103A | Directs air into the chambers at high pressure |
| Black Sharpie | Sharpie | S-19421 | Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later |
| Bottle Top Dispensor | Brand | Z627569 | Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe |
| BTE Chamber | Technology Evolving Solutions | TE002BB-A05-E1 | Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool |
| Dish Soap | Dawn | 57445CT | Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber |
| Fume hood with hepa filter | Air Science | P5-36XT-A | Fume hood with hepa filter (ASTS-030) to limit possible contamination and protect against chemical spills |
| Insulated foam shipping container | PolarTech | 261/J50C | Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected |
| Lab coat | Red Kap | KP14WH LN 46 | Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills |
| Laptop | Microsoft | Surface | Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base |
| NFC Capable Phone | Samsung | Galaxy S9 | Phone to download and use TES phone app |
| NFC clip tag | Technology Evolving Solutions | TE005-Clip-E1 | Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app |
| NFC Collar Tag | Technology Evolving Solutions | TE005-Collar-E1 | Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app |
| Nitrile Gloves | Usa Scientific | 3915-4400 | Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills |
| Noise-Reducing Earmuff | 3M | 90565-4DC-PS | Protect ears while operating air compressor and tissue processing base |
| Polyurethane Recoil Air Hose | FYPower | 510019 | Attaches air gun to compressor |
| Saftey glasses | Solidwork | SW8329-US | Protect eyes for chemical and physical hazards |
| Spray bottle | JohnBee | B08QM81BJV | Spray bleach to deconatinate surfaces |
| Tissue Extractor Base | Technology Evolving Solutions | TE001-A-E1 | System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench |
| Tissue Processing Base Weight Scale | Technology Evolving Solutions | TE003-A05-200g-01-E1 | 200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield |
| Vermiculite | EasyGoProducts | B07WQDZGRP | Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service |
| Wire Cutter | Boenfu | BOWC-06002-US | Wire cutters to cut trimmer line |
Riferimenti
- Vernière, C., et al. Interactions between citrus viroids affect symptom expression and field performance of clementine trees grafted on trifoliate orange. Phytopathology. 96 (4), 356-368 (2006).
- Vernière, C., et al. Citrus viroids: Symptom expression and effect on vegetative growth and yield of clementine trees grafted on trifoliate orange. Plant Disease. 88 (11), 1189-1197 (2004).
- Zhou, C., Talon, M., Caruso, M., Gmitter, F. G., et al. Chapter 19 – Citrus viruses and viroids. The Genus Citrus. , 391-410 (2020).
- Trends and issues facing the U.S. citrus industry. Choices Magazine Online Available from: https://www.choicesmagazine.org/choices-magazine/theme-articles/trends-and-challenges-in-fruit-and-tree-nut-sectors/trends-and-issues-facing-the-us-citrus-industry (2021)
- Fruit and Tree Nuts Outlook. United States Department of Agriculture-Economic Research Service Available from: https://www.ers.usda.gov/webdocs/outlooks/98171/fts-370.pdf?v=5697 (2020)
- Forsyth, J., Fruits Damiani, J. C. i. t. r. u. s. Citrus Fruits. Types on the market. Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition. , 1329-1335 (2003).
- Bostock, R. M., Thomas, C. S., Hoenisch, R. W., Golino, D. A., Vidalakis, G. Plant health: How diagnostic networks and interagency partnerships protect plant systems from pests and pathogens. California Agriculture. 68 (4), 117-124 (2014).
- Osman, F., Dang, T., Bodaghi, S., Vidalakis, G. One-step multiplex RT-qPCR detects three citrus viroids from different genera in a wide range of hosts. Journal of Virological Methods. 245, 40-52 (2017).
- Wang, J., et al. Past and future of a century old Citrus tristeza virus collection: A California citrus germplasm tale. Frontiers in Microbiology. 4, 366 (2013).
- Gergerich, R. C., et al. Safeguarding fruit crops in the age of agricultural globalization. Plant Disease. 99 (2), 176-187 (2015).
- Moreno, P., Ambrós, S., Albiach-Martí, M. R., Guerri, J., Peña, L. Citrus tristeza virus: A pathogen that changed the course of the citrus industry. Molecular Plant Pathology. 9 (2), 251-268 (2008).
- Yokomi, R. K., et al. Identification and characterization of Citrus tristeza virus isolates breaking resistance in trifoliate orange in California. Phytopathology. 107 (7), 901-908 (2017).
- Selvaraj, V., Maheshwari, Y., Hajeri, S., Yokomi, R. A rapid detection tool for VT isolates of Citrus tristeza virus by immunocapture-reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification assay. PLoS One. 14 (9), 0222170 (2019).
- Babcock, B. A. Economic impact of California’s citrus industry in 2020. Journal of Citrus Pathology. 9, (2022).
- Gottwald, T. R., Polek, M., Riley, K. History, present incidence, and spatial distribution of Citrus tristeza virus in the California central valley. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15, (2002).
- Yokomi, R., et al. Molecular and biological characterization of a novel mild strain of citrus tristeza virus in California. Archives of Virology. 163 (7), 1795-1804 (2018).
- Fuchs, M., et al. Economic studies reinforce efforts to safeguard specialty crops in the United States. Plant Disease. 105 (1), 14-26 (2021).
- The real cost of HLB in Florida. Citrus Industry Magazine Available from: https://citrusindustry.net/2019/07/30/the-real-cost-of-hib-in-florida/ (2019)
- McRoberts, N., et al. Using models to provide rapid programme support for California’s efforts to suppress Huanglongbing disease of citrus. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 374 (1776), 20180281 (2019).
- Albrecht, C., et al. Action plan for Asian citrus psyllid and huanglongbing (citrus greening) in California. Journal of Citrus Pathology. 7 (1), (2020).
- Navarro, L., et al. The Citrus Variety Improvement Program in Spain in the period 1975-2001. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15 (15), (2002).
- Vidalakis, G., Gumpf, D. J., Polek, M. L., Bash, J. A., Ferguson, L., Grafton-Cardwell, E. E. The California Citrus Clonal Protection Program. Citrus Production Manual. , 117-130 (2014).
- Dang, T., Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G., et al. High-throughput RNA extraction from citrus tissues for the detection of viroids. In Viroids: Methods and Protocols. 2316, (2022).
- Osman, F., Vidalakis, G., Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. Real-time detection of viroids using singleplex and multiplex quantitative polymerase chain reaction. Viroids: Methods and Protocols. 2316, (2022).
- Li, R., et al. A reliable and inexpensive method of nucleic acid extraction for the PCR-based detection of diverse plant pathogens. Journal of Virological Methods. 154 (1-2), 48-55 (2008).
- Saponari, M., Manjunath, K., Yokomi, R. K. Quantitative detection of Citrus tristeza virus in citrus and aphids by real-time reverse transcription-PCR (TaqMan). Journal of Virological Methods. 147 (1), 43-53 (2008).
- Damaj, M. B., et al. Reproducible RNA preparation from sugarcane and citrus for functional genomic applications. International Journal of Plant Genomics. 2009, 765367 (2009).
- Dang, T., et al. First report of citrus leaf blotch virus infecting Bearss lime tree in California. Plant Disease. 104 (11), 3088 (2020).
- Manchester, K. L. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. BioTechniques. 20 (6), 968-970 (1996).
- Teare, J. M., et al. Measurement of nucleic acid concentrations using the DyNA QuantTM and the GeneQuantTM. BioTechniques. 22 (6), 1170-1174 (1997).
- Imbeaud, S. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 56-56 (2005).
- Menzel, W., Jelkmann, W., Maiss, E. Detection of four apple viruses by multiplex RT-PCR assays with coamplification of plant mRNA as internal control. Journal of Virological Methods. 99 (1-2), 81-92 (2002).
- Vidalakis, G., Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G., et al. SYBR Green RT-qPCR for the universal detection of citrus viroids. Viroids: Methods and Protocols. , 211-217 (2022).
- Arredondo Valdés, R., et al. A review of techniques for detecting Huanglongbing (greening) in citrus. Canadian Journal of Microbiology. 62 (10), 803-811 (2016).
- Li, S., Wu, F., Duan, Y., Singerman, A., Guan, Z. Citrus greening: Management strategies and their economic impact. HortScience. 55 (5), 604-612 (2020).
- . CDFA California Citrus Pest and Disease Prevention Program Operations Subcomittee Meeting. Meeting Minutes Available from: https://www.cdfa.ca.gov/citrus/docs/minutes/2019/OpsSubcoMinutes-11062019.pdf (2019)
