Denne protokol beskriver en metode til isolering og identifikation af fedtvævsafledte mesenkymale stamceller (MSC’er) fra Sprague Dawley-rotter.
Voksne mesenkymale celler har revolutioneret molekylær- og cellebiologi i de seneste årtier. De kan differentiere sig i forskellige specialiserede celletyper ud over deres store kapacitet til selvfornyelse, migration og spredning. Fedtvæv er en af de mindst invasive og mest tilgængelige kilder til mesenkymale celler. Det er også blevet rapporteret at have højere udbytter sammenlignet med andre kilder, samt overlegne immunmodulerende egenskaber. For nylig er forskellige procedurer til opnåelse af voksne mesenkymale celler fra forskellige vævskilder og dyrearter blevet offentliggjort. Efter at have evalueret kriterierne for nogle forfattere standardiserede vi en metode, der er anvendelig til forskellige formål og let reproducerbar. En pulje af stromal vaskulær fraktion (SVF) fra perirenal og epididymalt fedtvæv tillod os at udvikle primære kulturer med optimal morfologi og funktionalitet. Cellerne blev observeret klæbet til plastoverfladen i 24 timer og udviste en fibroblastlignende morfologi med forlængelser og en tendens til at danne kolonier. Flowcytometri (FC) og immunofluorescens (IF) teknikker blev anvendt til at vurdere ekspressionen af membranmarkørerne CD105, CD9, CD63, CD31 og CD34. Fedtafledte stamcellers (ASC’ers) evne til at differentiere sig til den adipogene afstamning blev også vurderet ved hjælp af en cocktail af faktorer (4 μM insulin, 0,5 mM 3-methyl-iso-butyl-xanthin og 1 μM dexamethason). Efter 48 timer blev der observeret et gradvist tab af fibroblastoid morfologi, og efter 12 dage blev tilstedeværelsen af lipiddråber, der var positive for olierød farvning, bekræftet. Sammenfattende foreslås en procedure for at opnå optimale og funktionelle ASC-kulturer til anvendelse i regenerativ medicin.
Mesenkymale stamceller (MSC’er) har haft stor indflydelse på regenerativ medicin på grund af deres høje kapacitet til selvfornyelse, spredning, migration og differentiering i forskellige cellelinjer 1,2. I øjeblikket fokuserer en stor del af forskningen på deres potentiale til behandling og diagnose af forskellige sygdomme.
Der er forskellige kilder til mesenkymale celler: knoglemarv, skeletmuskulatur, fostervand, hårsække, placenta og fedtvæv, blandt andre. De fås fra forskellige arter, herunder mennesker, mus, rotter, hunde og heste3. Knoglemarvsafledte MSC’er (BMSC’er) har været anvendt i mange år som en vigtig kilde til stamceller i regenerativ medicin og som et alternativ til brugen af embryonale stamceller4. Imidlertid er fedtafledte MSC’er eller fedtafledte stamceller (ASC’er) et vigtigt alternativ med store fordele på grund af deres lette indsamling og isolering samt udbyttet af celler opnået pr. gram fedtvæv 5,6. Det er blevet rapporteret, at høstraten for ASC’er generelt er højere end for BMSC’er7. Det blev oprindeligt foreslået, at ASC’ernes reparative/regenerative kapacitet skyldtes deres evne til at differentiere sig til andre cellelinjer8. Forskning i de senere år har imidlertid forstærket den primære rolle af parakrinefaktorer frigivet af ASC’er i deres reparative potentiale 9,10.
Fedtvæv (AT) interagerer ud over at være en energireserve med de endokrine, nervøse og kardiovaskulære systemer. Det er også involveret i postnatal vækst og udvikling, vedligeholdelse af vævshomeostase, vævsreparation og regenerering. AT består af adipocytter, vaskulære glatte muskelceller, endotelceller, fibroblaster, monocytter, makrofager, lymfocytter, preadipocytter og ASC’er. Sidstnævnte har en vigtig rolle i regenerativ medicin på grund af deres lave immunogenicitet11,12. ASC’er kan opnås ved enzymatisk fordøjelse og mekanisk behandling eller ved fedtvævseksplanter. Primære kulturer af ASC’er er nemme at vedligeholde, dyrke og udvide. Fænotypisk karakterisering af ASC’er er afgørende for at verificere cellernes identitet ved at vurdere ekspressionen af specifikke membranmarkører ved hjælp af metoder som immunofluorescens og flowcytometri13. International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) og International Society for Cellular Therapy (ISCT) har defineret, at ASC’er udtrykker CD73, CD90 og CD105, mens de mangler udtrykket CD11b, CD14, CD19, CD45 og HLA-DR14. Disse markører, både positive og negative, betragtes derfor som pålidelige til karakterisering af ASC’er.
Dette projekt fokuserede på at beskrive en procedure til isolering og identifikation af voksne mesenkymale celler udvundet af rotters AT, da denne cellekilde ikke giver etiske udfordringer, i modsætning til embryonale stamceller. Dette styrker proceduren som en levedygtig mulighed på grund af den lette adgang og minimalt invasive metode sammenlignet med knoglemarvsafledte stamceller.
Mesenkymale celler fra denne vævskilde har en vigtig rolle i regenerativ medicin på grund af deres immunmodulerende evner og lave immunafstødning. Derfor er denne undersøgelse en grundlæggende del af fremtidig forskning i deres sekretom og deres anvendelse som regenerativ terapi i forskellige sygdomme, herunder metaboliske sygdomme som diabetes.
I de sidste fire årtier siden opdagelsen af MSC’er har flere grupper af forskere beskrevet procedurer for opnåelse af MSC’er fra forskellige væv og arter. En af fordelene ved at bruge rotter som dyremodel er deres nemme vedligeholdelse og hurtige udvikling samt den lette opnåelse af MSC’er fra fedtvæv. Forskellige vævskilder er blevet beskrevet til opnåelse af ASC’er, såsom visceralt, perirenalt, epididymalt og subkutant fedt 12,13,14,15,16.<su…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne er taknemmelige over for det mexicanske institut for social sikring (IMSS) og Children’s Hospital of Mexico, Federico Gomez (HIMFG) og Bioterio-personalet i IMSS Research Coordination for den støtte, der er givet til at gennemføre dette projekt. Vi takker National Council of Science and Technology for AOC (815290) stipendiet og Antonio Duarte Reyes for den tekniske support i det audiovisuelle materiale.
Amphotericin B | HyClone | SV30078.01 | |
Analytical balance | Sartorius | AX224 | |
Antibody anti- CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
Antibody anti-CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
Antibody anti-C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) | RD Systems. | No. F103B | |
Bottle Top Filter Sterile | CORNING | 10718003 | |
Cell and Tissue Culture Flasks | BIOFIL | 170718-312B | |
Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
Cell wells: 6 well with Lid | CORNING | 25810 | |
Centrifuge conical tubes | HeTTICH | ROTANA460R | |
Centrifuge eppendorf tubes | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | Free version | |
CytoFlex LX cytometer | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
DraQ7 Dye | Thermo Sc. | D15106 | |
EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
Eosin yellowish | Hycel | 300 | |
Ethanol 96% | Baker | 64-17-5 | |
Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
Fetal Bovine Serum | CORNING | 35-010-CV | |
Gelatin | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
Gentamicin | GIBCO | 15750045 | |
Glycerin-High Purity | Herschi Trading | 56-81-5 | |
Hematoxylin | AMRESCO | 0701-25G | |
Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Sc. | 50116047 | |
Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate) | Aranda | SV057430 | |
L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
LSM software Zen 2009 V5.5 | Free version | ||
Biological Safety Cabinet Class II | NuAire | 12082100801 | |
Epifluorescent microscope | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
Inverted microscope | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
Non-essential amino acids 100X | GIBCO | 11140050 | |
Micro tubes 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
Micro tubes 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
Micropipettes 0.2-2 μL | Finnpipette | E97743 | |
Micropipettes 2-20 μL | Finnpipette | F54167 | |
Micropipettes 20-200 μL | Finnpipette | G32419 | |
Micropipettes 100-1000 μL | Finnpipette | FJ39895 | |
Nitrogen tank liquid | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
Paraformaldehyde | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
Petri dish Cell culture | CORNING Inc | 480167 | |
Pipet Tips | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
Pisabental (pentobarbital sodium) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
Potassium chloride | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
Potassium Phosphate Dibasic | J.T Baker | 2139900 | |
S1 Pipette Fillers | Thermo Sc | 9531 | |
Serological pipette 5 mL | PYREX | L010005 | |
Serological pipette 10 mL | PYREX | L010010 | |
Sodium bicarbonate | J.T Baker | 144-55-8 | |
Sodium chloride | J.T.Baker | 15368426 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | J.T Baker | 7558-79-4 | |
Sodium pyruvate | GIBCO BRL | 11840-048 | |
Syringe Filter Sterile | CORNING | 431222 | |
Spectrophotometer | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
Titer plate shaker | LAB-LINE | 1250 | |
Transfer pipets | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
Trypan Blue stain | GIBCO | 1198566 | |
Trypsin From Porcine Pancreas | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
Universal Blocking Reagent 10x | BioGenex | HK085-GP | |
Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) | Pet's Pharma | Q-7972-025 |