Questo protocollo descrive una metodologia per isolare e identificare le cellule staminali mesenchimali (MSC) derivate dal tessuto adiposo da ratti Sprague Dawley.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Isolamento e identificazione di cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo di ratti Sprague Dawley
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule mesenchimali adulte hanno rivoluzionato la biologia molecolare e cellulare negli ultimi decenni. Possono differenziarsi in diversi tipi di cellule specializzate, oltre alla loro grande capacità di auto-rinnovamento, migrazione e proliferazione. Il tessuto adiposo è una delle fonti meno invasive e più accessibili di cellule mesenchimali. È stato anche segnalato per avere rese più elevate rispetto ad altre fonti, così come proprietà immunomodulatorie superiori. Recentemente sono state pubblicate diverse procedure per ottenere cellule mesenchimali adulte da diverse fonti tissutali e specie animali. Dopo aver valutato i criteri di alcuni autori, abbiamo standardizzato una metodologia applicabile a scopi diversi e facilmente riproducibile. Un pool di frazione vascolare stromale (SVF) proveniente da tessuto adiposo perirenale ed epididimo ci ha permesso di sviluppare colture primarie con morfologia e funzionalità ottimali. Le cellule sono state osservate aderire alla superficie plastica per 24 ore e hanno mostrato una morfologia simile ai fibroblasti, con prolungamenti e tendenza a formare colonie. Sono state utilizzate tecniche di citometria a flusso (FC) e immunofluorescenza (IF) per valutare l'espressione dei marcatori di membrana CD105, CD9, CD63, CD31 e CD34. La capacità delle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ASC) di differenziarsi nella linea adipogena è stata valutata anche utilizzando un cocktail di fattori (4 μM di insulina, 0,5 mM di 3-metil-iso-butil-xantina e 1 μM di desametasone). Dopo 48 ore, è stata osservata una graduale perdita della morfologia fibroblastoide e, a 12 giorni, è stata confermata la presenza di goccioline lipidiche positive alla colorazione rosso olio. In sintesi, viene proposta una procedura per ottenere colture ASC ottimali e funzionali per l'applicazione in medicina rigenerativa.
Introduzione
Le cellule staminali mesenchimali (MSC) hanno fortemente influenzato la medicina rigenerativa grazie alla loro elevata capacità di auto-rinnovamento, proliferazione, migrazione e differenziazione in diverse linee cellulari 1,2. Attualmente, una grande quantità di ricerca si sta concentrando sul loro potenziale per il trattamento e la diagnosi di varie malattie.
Esistono diverse fonti di cellule mesenchimali: midollo osseo, muscolo scheletrico, liquido amniotico, follicoli piliferi, placenta e tessuto adiposo, tra gli altri. Sono ottenuti da diverse specie, tra cui esseri umani, topi....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite seguendo le linee guida messicane per la cura degli animali, basate sulle raccomandazioni dell'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali da laboratorio internazionale (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Messico). Il protocollo è stato rivisto, approvato e registrato dal Comitato etico per la ricerca sanitaria dell'Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092).
1. Rimozione del tessuto adiposo dai ratti mediante resezione chirurgica
- Preparare due provette coniche con 20 ml di soluzione sterile tamponata con fosfato t....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Il tessuto adiposo è stato ottenuto da ratti adulti Sprague Dawley di età compresa tra 3 e 4 mesi e con un peso corporeo di 401 ± 41 g (media geometrica ± DS). Un valore medio di 3,8 g di tessuto adiposo epididimo e perirenale corrispondeva all'analisi di 15 estrazioni sperimentali. Dopo 24 ore di coltura, le popolazioni cellulari sono rimaste aderenti alla superficie plastica e hanno mostrato una morfologia eterogenea. Il primo passaggio è stato realizzato a 8 ± 2 giorni, con una resa di 1,4 ± 0,6 x 106 celle.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Negli ultimi quattro decenni dalla scoperta delle MSC, diversi gruppi di ricercatori hanno descritto procedure per ottenere MSC da diversi tessuti e specie. Uno dei vantaggi dell'utilizzo dei ratti come modello animale è la loro facile manutenzione e il rapido sviluppo, nonché la facilità di ottenere MSC dal tessuto adiposo. Diverse fonti tissutali sono state descritte per ottenere ASC, come il grasso viscerale, perirenale, epididimico e sottocutaneo 12,13,14,15,16.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Gli autori sono grati all'Istituto messicano di sicurezza sociale (IMSS) e all'ospedale pediatrico del Messico, Federico Gomez (HIMFG) e allo staff Bioterio del Coordinamento della ricerca IMSS, per il supporto dato alla realizzazione di questo progetto. Ringraziamo il Consiglio Nazionale della Scienza e della Tecnologia per la borsa di studio AOC (815290) e Antonio Duarte Reyes per il supporto tecnico nel materiale audiovisivo.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Amfotericina B | HyClone | SV30078.01 | |
| Bilancia analitica | Sartorius | AX224 | |
| Anticorpo anti-CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
| Anticorpo anti-CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
| Anticorpo anti-C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
| Anticorpo anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
| Anticorpo anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
| Anticorpo Capra anti-rabbia IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
| Anticorpo Asino anti-capra IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
| Anticorpo anti-topo IgG FITC capra coniugata F (ab´) | Sistemi RD. | No. F103B | |
| Filtro per flaconi Sterile | CORNING | 10718003 | |
| Fiasche per colture cellulari e tissutali | BIOFIL | 170718-312B | |
| Contatore di cellule Ematocitometro a linea chiara con vetrini per camera di conteggio delle cellule | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
| Pozzetti per cellule: 6 pozzetti con coperchio | CORNING | 25810 | |
| Provette | coniche per centrifugaHeTTICH | ROTANA460R | |
| Provette per centrifuga eppendorf | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
| Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
| Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
| Provette per coltura | Greiner Bio-One | 191180 | |
| CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | Versione | |
| Citometro CytoFlex LX | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
| DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
| DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
| DraQ7 Dye | Thermo Sc. | D15106 | |
| EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
| Eosina giallastra | Hycel | 300 | |
| Etanolo 96% | Baker | 64-17-5 | |
| Provette Falcon 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Provette Falcon 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Siero fetale bovino | CORNING | 35-010-CV | |
| Gelatina | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
| Gentamicina | GIBCO | 15750045 | |
| Glicerina-Alta Purezza | Herschi Trading | 56-81-5 | |
| Ematossilina | AMRESCO | 0701-25G | |
| Heracell 240i CO2 Incubatore | Thermo Sc. | ||
| Ketamin Pet (ketamina cloridrate) | Aranda | SV057430 | |
| L-Glutammina | GIBCO / Thermo Sc. | 25030-081 | |
| Software LSM Zen 2009 V5.5 | Versione | ||
| Cabina di sicurezza biologica Classe II | NuAire | 12082100801 | |
| Microscopio epifluorescente | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
| Microscopio invertito | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
| Aminoacidi non essenziali 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Microprovette 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
| Microprovette 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| Micropipette 0,2-2 μ L | Finnpipette | E97743 | |
| Micropipette 2-20 μ L | Finnpipette | F54167 | |
| Micropipette 20-200 μ L | Finnpipette | G32419 | |
| Micropipette 100-1000 μ L | Finnpipette | FJ39895 | |
| Serbatoio di azoto liquido | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
| Paraformaldeide | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
| Penicillina / Streptomicina | GIBCO / Thermo Sc. | ||
| Piastra di Petri Coltura cellulare | CORNING Inc | 480167 | |
| Pipet Tips | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
| Pisabental (pentobarbital sodico) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
| Cloruro di potassio | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
| Fosfato di potassio bibasico | J.T Baker | 2139900 | |
| S1 Pipette Filler | Thermo Sc | 9531 | |
| Pipetta sierologica 5 mL | PYREX | L010005 | |
| Pipetta sierologica 10 mL | PYREX | L010010 | |
| Bicarbonato di sodio | J.T Baker | 144-55-8 | |
| Cloruro di sodio | J.T.Baker | 15368426 | |
| Fosfato di sodio bibasico anidro | J.T Baker | 7558-79-4 | |
| Piruvato di sodio | GIBCO BRL | 11840-048 | |
| Filtro per siringa Sterile | CORNING | 431222 | |
| Spettrofotometro | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
| Agitatore per piastre per titoli | LAB-LINE | 1250 | |
| Pipette di trasferimento | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
| Trypan Blue colorante | GIBCO | 1198566 | |
| tripsina dal pancreas suino | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
| Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
| Reagente bloccante universale 10x | BioGenex | HK085-GP | |
| Xilapet 2% (xilazina cloridrato) | Pet' s Pharma | Q-7972-025 |
Riferimenti
- Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of \anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
- Greenwood, M. R., Hirsch, J.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
