Her presenterer vi en samling analyser for direkte måling av mitokondriell funksjon i pattedyrceller uavhengig av deres evne til å konsumere molekylært oksygen.
Strømmen av elektroner i den mitokondrielle elektrontransportkjeden (ETC) støtter mangefasetterte biosyntetiske, bioenergetiske og signalfunksjoner i pattedyrceller. Siden oksygen (O2) er den mest allestedsnærværende terminale elektronakseptoren for pattedyrs ETC, brukesO2-forbrukshastigheten ofte som en proxy for mitokondriell funksjon. Ny forskning viser imidlertid at denne parameteren ikke alltid er indikativ for mitokondriell funksjon, da fumarat kan brukes som en alternativ elektronakseptor for å opprettholde mitokondrielle funksjoner i hypoksi. Denne artikkelen samler en rekke protokoller som tillater forskere å måle mitokondriell funksjon uavhengig av O2-forbruket. Disse analysene er spesielt nyttige når man studerer mitokondriell funksjon i hypoksiske miljøer. Spesielt beskriver vi metoder for å måle mitokondriell ATP-produksjon, de novo pyrimidinbiosyntese, NADH-oksidasjon ved kompleks I og superoksidproduksjon. I kombinasjon med klassiske respirometrieksperimenter vil disse ortogonale og økonomiske analysene gi forskere en mer omfattende vurdering av mitokondriell funksjon i deres interessesystem.
Mitokondriell funksjon er en kritisk beregning av cellulær helse, da den opprettholder viktige biosyntetiske, bioenergetiske og signalfunksjoner i pattedyrceller1. De aller fleste mitokondriefunksjoner krever elektronstrøm gjennom elektrontransportkjeden (ETC), og forstyrrelser i elektronstrømmen i ETC forårsaker alvorlig mitokondriesykdom2. ETC består av en serie reduksjons- og oksidasjonsreaksjoner (redoks) som er innebygd i den indre mitokondriemembranen, og disse elektronoverføringsreaksjonene frigjør fri energi som kan utnyttes for å støtte ATP-syntese, fysiologiske prosesser som termogenese, biosyntetiske veier som de novo pyrimidin biosyntese, og balansen mellom redoksstatusen til kofaktorer som NADH. ETC-kompleks I og III produserer reaktive oksygenarter (ROS) 3,4,5, som igjen regulerer signaleringsveier som HIF, PI3K, NRF2, NFκB og MAPK 6. Følgelig er beregninger av elektronstrøm i ETC klassisk brukt som en proxy for mitokondriell funksjon i pattedyrceller.
Respirometri eksperimenter er ofte ansatt for å måle mitokondriell funksjon i pattedyrceller. Siden O2 er den mest allestedsnærværende terminale elektronakseptoren for pattedyrs ETC, brukes reduksjonen som en proxy for mitokondriell funksjon. Imidlertid viser nye bevis at pattedyrs mitokondrier kan bruke fumarat som en elektronakseptor for å opprettholde mitokondrielle funksjoner som er avhengige av ETC, inkludert de novo pyrimidin biosyntese 7, NADH oksidasjon7 og avgiftning av hydrogensulfid8. I visse sammenhenger, spesielt i hypoksiske miljøer, gir målinger avO2-forbrukshastigheten (OCR) derfor ikke en presis eller nøyaktig indikasjon på mitokondriell funksjon.
Her skisserer vi en rekke analyser som kan brukes til å måle mitokondriell funksjon uavhengig av OCR. Vi tilbyr analyser for direkte å måle kompleks I-mediert NADH-oksidasjon, dihydroorotat dehydrogenase-mediert de novo pyrimidin biosyntese, kompleks V-avhengig ATP-syntese, nettoretningen til succinat dehydrogenase (SDH) kompleks og mitokondriell avledet ROS. Disse analysene er ment å bli utført på dyrkede pattedyrceller, selv om mange kan tilpasses for å studere mitokondrielle funksjoner in vivo. Spesielt er analysene beskrevet i denne protokollen mer direkte målinger av mitokondrielle funksjoner enn OCR. Videre muliggjør de måling av mitokondriell funksjon i hypoksi, en kontekst der OCR ikke er en indikativ måling. Samlet sett vil disse analysene, i kombinasjon med klassiske respirometrieksperimenter, gi forskere en mer omfattende vurdering av mitokondriell funksjon i pattedyrceller.
Som ny forskning viser at pattedyrs mitokondrier kan fungere uten å konsumere molekylært oksygen, er det av største betydning for forskere å bruke ortogonale analyser, utover OCR-målinger, for nøyaktig kvantifisering av mitokondriell funksjon. Her samlet vi en rekke analyser som kan brukes til å direkte vurdere aktivitetene til kompleks I, kompleks II, kompleks V og DHODH ved å måle mitokondriell NAD + / NADH-balanse, utnyttelse av adaptive terminale elektronakseptorer, produksjon av ATP, de novo pyrimidin biosyntese og mitokondrie-avledet ROS. Spesielt måler disse analysene mer direkte mitokondriell funksjon enn OCR-målinger. Videre gir disse analysene forskere traktable måter å kvantifisere mitokondriell funksjon under hypoksi, for hvilke OCR-målinger i stor grad er irrelevante på grunn av at fumarat brukes som den favoriserte terminale elektronakseptoren. Endelig er de spredningsbaserte metodene beskrevet her mer kostnadseffektive enn klassiske respirometrieksperimenter, og gir dermed en bredt tilgjengelig måte å studere mitokondriell funksjon i pattedyrsystemer.
Det er viktige hensyn når man bruker disse analysene til å måle mitokondriell funksjon i dyrkede celler. Når det gjelder spredningsanalysene, er det viktig å justere antall celler som er sådd for doblingshastigheten for hver cellelinje. Cellene bør sås til minst 10% sammenløp og med nok plass til å tillate tre til fire doblinger slik at forskjeller i spredning kan kvantifiseres. En annen vurdering for hver analyse er konsentrasjonen av de små molekylene som brukes som kontroller for aktivitetene til hvert ETC-kompleks. Siden forskjellige cellelinjer kan utvise forskjellige følsomheter overfor disse inhibitorene, er det viktig å teste dosen av disse små molekylene for å identifisere den optimale konsentrasjonen.
En universell begrensning av analyser som studerer mitokondriell funksjon in vitro, inkludert OCR-målinger og alle analysene beskrevet her, er den metabolske sammensetningen av kulturmediet. Standard cellekulturmedium har en tendens til å skjevgjøre systemer til overfladisk høye nivåer av mitokondriell funksjon. For eksempel øker suprafysiologiske glutaminnivåer sin anaplerose av TCA-syklusen25, som brenner mitokondriell NADH-syntese og følgelig øker oksidativ fosforylering. Tilsvarende varierer partialtrykket av oksygen mellom 3 mmHg og 100 mmHg (ca. 0,1% -13%O2) i pattedyrvev, men er atmosfærisk (140 mmHg, ca. 21%) in vitro26,27. Dette overskuddet av O2 maksimerer mitokondriell respiratorisk kapasitet og superoksidproduksjon28. Nylig har det blitt gjort forsøk på å designe kulturmedier til å være mer fysiologiske29,30. Spesielt reduserer dyrking av celler i humane plasmalignende medier mitokondriell respirasjon i noen kreftcellelinjer30, mitokondriell ROS i T-celler 31 og mitokondrielle tilpasninger til kreftbehandling32. Det er derfor viktig å være oppmerksom på sammensetningen av kulturmediene som brukes og forstå hvordan det kan påvirke mitokondriefunksjonen.
En annen viktig og universell begrensning i tolkningen av mitokondriell funksjon er potensialet for forskjeller i antall mitokondrier. Det er derfor kritisk å måle mitokondrieinnholdet gjennom enten kvantifisering av mtDNA33, måling av mitokondriemasse med membranpotensial-ufølsomme fargestoffer34, eller vestlig blotting av mitokondriemarkører. Dette er en kritisk kontroll, slik at en reduksjon i antall mitokondrier ikke forveksles med en reduksjon i mitokondriell funksjon.
Det er også spesifikke begrensninger og feilsøking som gjelder for analysene beskrevet her. For det første, gitt at differensierte celler ikke prolifererer, vil de proliferasjonsbaserte analysene ikke være nyttige for å vurdere mitokondriell funksjon i denne sammenhengen. En viktig begrensning i 13C 4-aspartatsporingsprotokollen for å måle DHODH-aktivitet er at aspartatopptak i celler kan være ekstremt ineffektivt35. For å overvinne denne potensielle begrensningen kan forskere overuttrykke aspartattransportøren, SLC1A3, for å lette 13C 4-aspartatopptak35.
En begrensning av protokollen ved bruk av 13C 5-glutaminsporing for å måle SDH-aktivitet er at denne analysen krever at celler bruker den reduktive karboksyleringsveien for å berike M + 3-isotopologene for å måle omvendt aktivitet. Noen cellelinjer er ikke i stand til reduktiv karboksyleringsfluks på grunn av lavt ATP-citratlyaseuttrykk36, utilstrekkelig HIF-stabilisering 37 eller et α-KG: citratforhold som er for lavt38. For å overvinne denne begrensningen kunne man bruke 13C 4-aspartatsporing for å måle SDH fremover og revers aktiviteter7. I denne analysen kan SDH forward-aktiviteten måles ved forholdet mellom fumarat M + 2: succinate M + 2 og omvendt reaksjon ved succinat M + 4: fumarat M + 4. Spesielt omgår denne sporingen de fleste enzymene i den reduktive karboksyleringsveien.
En begrensning av den komplekse I-aktivitetsanalysen ved bruk av DCPIP-reduksjon som avlesning er at mitokondriene ikke er strukturelt intakte. Prosessen med frysetining av mitokondriene for å muliggjøre deres NADH-opptak for analysen, kan sikkert anløpe den strukturelle integriteten til mitokondriemembranen39. Denne analysen bør utføres parallelt med analyser som den komplekse I-proliferasjonsanalysen for å sikre at endringene i kompleks I-aktivitet observert også er sanne med intakte celler.
I fremtidige studier kan noen av disse teknikkene tilpasses for å måle mitokondrielle funksjoner in vivo ved hjelp av modellorganismer som mus og Caenorhabditis elegans. De nåværende metodene som brukes til å måle mitokondriell funksjon in vivo er sentrert på OCR på organismenivå, spesielt respiratorisk utvekslingshastighet ved bruk av musemodeller. En klar begrensning av denne metoden er at oksygen tjener mange biokjemiske og signalfunksjoner utover sin rolle som en allestedsnærværende terminal elektronakseptor i mitokondriell ETC. For eksempel blir oksygen “forbrukt” av den katalytiske aktiviteten til enzymer i dioksygenasefamilien. Selv om disse enzymene bidrar til det cellulære oksygenforbruket, deltar de ikke i, regulerer eller reflekterer mitokondriell funksjon. Klassiske respirometrieksperimenter in vitro kontrollerer vanligvis for “ikke-mitokondriell OCR”, mens eksperimenter med organisatorisk respiratorisk utveksling (RER) ikke kan kontrollere for dette, og begrenser tolkningen av RER som en metrisk for mitokondriell funksjon in vivo. Imidlertid er det mulig å tilpasse protokollene for å måle DHODH-aktivitet via 13 C 4-aspartatsporing, kompleks II-aktivitet via 13C5-glutaminsporing, kompleks I-aktivitet på mitokondrier renset fra vev og mitokondriell ROS ved bruk av LC-MS-vennlige forbindelser som MitoB for å måle mitokondriefunksjon in vivo . Disse direkte analysene for å undersøke mitokondrielle funksjoner, i kombinasjon med klassiske respirometrieksperimenter, gir forskere en mer omfattende og nøyaktig vurdering av mitokondriell funksjon i pattedyrceller og vev.
The authors have nothing to disclose.
Figurene som produseres i dette manuskriptet ble laget med BioRender.com. Vi er takknemlige for at Amy Walker gir tilbakemelding på denne artikkelen. J.B.S. ble støttet av Worcester Foundation for Biomedical Research Grant.
1.5 mL tube | Cell Treat | 667443 | |
2.0 mL tube | Cell Treat | 229446 | |
6-well plate | Cell Treat | 229106 | |
12-well plate | Cell Treat | 229112 | |
13C4-aspartate | Sigma-Aldrich | 604852 | |
13C5-Glutamine | Cambridge Isotope Laboratories | 285978-14-5 | |
15 mL centrifuge tube | Cell Treat | 667411 | |
50 mL centrifuge tube | Cell Treat | 667421 | |
150 mm tissue culture dish | Cell Treat | 229651 | |
1x Phosphate-buffered saline | Gibco | 10010049 | |
2,6-dichlorophenolindophenol | Honeywell | 33125 | |
Ammonium Carbonate | Sigma-Aldrich | 37999 | |
Antimycin | Sigma-Aldrich | A8674 | |
Ascentis Express C18 | Sigma-Aldrich | 53825-U | |
Bottle top filter 500 mL, 0.22 µm, PES 9 9 mm membrane diameter | Cell Treat | 229717 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
Brequinar | Sigma-Aldrich | SML0113 | |
Cell Lifter, Double End Flat and Narrow Blade | Cell Treat | 229305 | |
CentriVap -105 Cold Trap | Labconco | 7385020 | |
Complete Protease Inhibitor Tablets | Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
Coulter Counter Cups | Fisher Scientific | 07-000-694 | |
Decylubiquinone | Sigma-Aldrich | D7911 | |
DMSO | Invitrogen | D12345 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Eppendorf Centrifuge 5425R | Eppendorf | 2231000908 | |
Eppendorf Centrifuge 5910 Ri | Eppendorf | 5943000343 | |
Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
Glucose-free DMEM | Gibco | 11966025 | |
Glutamine-free DMEM | Thermo Fisher | 11960044 | |
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
HPLC-grade 35% Ammonium hydroxide | Thermo Scientific | 460801000 | |
HPLC-grade Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 900667 | |
HPLC-grade Chloroform | Sigma-Aldrich | 366927 | |
HPLC-grade formic acid | Thermo Scientific | 28905 | |
HPLC-grade Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935 | |
HPLC-grade MeOH | Sigma-Aldrich | 900688 | |
HPLC-grade Water | Sigma-Aldrich | 270733 | |
Human Osteosarcome Cell Line 143B | ATCC | CRL-8303 | |
Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 320331-500ML | |
Isotone buffer | Beckman Coulter | 8546719 | |
K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P2222 | |
Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
MitoSox Red | Invitrogen | M36008 | |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
Pencillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Potter-Elvehjem Tissue Grinder, Size 21 | Kimble | 885502-0021 | |
Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
Pyruvate-free DMEM media | Gibco | 11965175 | |
Q Exactive Plus Mass Spectrometer | Thermo Scientific | 726030 | |
ReCO2ver Incubator | Baker | ||
Refrigerated Centrivap Benchtop Vacuum Concentrator | Labconco | 7310020 | |
RIPA Buffer | Millipore Sigma | 20188 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
SeQuant ZIC-pHILIC 5μm 150 x 2.1 mm analytical column | Sigma-Aldrich | 1.50460.0001 | |
SeQuant ZIC-pHILIC guard kit | Millipore Sigma | 1.50438.0001 | |
Sodium Hydroxide, Pellets | Millipore Sigma | 567530-250GM | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
SW, TRACEFINDER 5.1 SP3 | Thermo Scientific | OPTON-31001 | |
Tert-butyl hydroperoxide solution | Sigma-Aldrich | 458139 | |
Tris | Sigma-Aldrich | 93352 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25-200-114 | |
Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | |
VANQUISH HORIZON / FLEX HPLC | Thermo Scientific | VF-S01-A-02 | |
Z2 Coulter Particle count and size analyzer | Beckman Coulter | BZ10131270 |