Her præsenterer vi en samling af assays til direkte måling af mitokondriefunktion i pattedyrceller uafhængigt af deres evne til at forbruge molekylært ilt.
Strømmen af elektroner i mitokondrieelektrontransportkæden (ETC) understøtter mangesidede biosyntetiske, bioenergetiske og signalfunktioner i pattedyrceller. Da ilt (O2) er den mest allestedsnærværende terminalelektronacceptor for pattedyrets ETC, anvendesO2-forbrugshastigheden ofte som en proxy for mitokondriefunktion. Ny forskning viser imidlertid, at denne parameter ikke altid er vejledende for mitokondriefunktion, da fumarat kan anvendes som en alternativ elektronacceptor til at opretholde mitokondriefunktioner i hypoxi. Denne artikel kompilerer en række protokoller, der gør det muligt for forskere at måle mitokondriefunktion uafhængigt af O2-forbrugshastigheden. Disse analyser er særligt nyttige, når man studerer mitokondriefunktion i hypoxiske miljøer. Specifikt beskriver vi metoder til måling af mitokondriel ATP-produktion, de novo pyrimidinbiosyntese, NADH-oxidation ved kompleks I og superoxidproduktion. I kombination med klassiske respirometrieksperimenter vil disse ortogonale og økonomiske assays give forskere en mere omfattende vurdering af mitokondriefunktionen i deres interessesystem.
Mitokondriefunktion er en kritisk måling af cellulær sundhed, da den opretholder vigtige biosyntetiske, bioenergetiske og signalfunktioner i pattedyrceller1. Langt de fleste mitokondriefunktioner kræver elektronstrøm gennem elektrontransportkæden (ETC), og forstyrrelser i elektronstrømmen i ETC forårsager alvorlig mitokondriesygdom2. ETC består af en række reduktions- og oxidationsreaktioner (redox), der er indlejret i den indre mitokondriemembran, og disse elektronoverførselsreaktioner frigiver fri energi, der kan udnyttes til at understøtte ATP-syntese, fysiologiske processer såsom termogenese, biosyntetiske veje såsom de novo pyrimidinbiosyntese og balancen mellem redoxstatus for co-faktorer såsom NADH. ETC-kompleks I og III producerer reaktive iltarter (ROS)3,4,5, som igen regulerer signalnøgleveje som HIF, PI3K, NRF2, NFκB og MAPK 6. Derfor anvendes målinger af elektronstrøm i ETC klassisk som en proxy for mitokondriefunktion i pattedyrceller.
Respirometri eksperimenter anvendes ofte til at måle mitokondrie funktion i pattedyr celler. DaO2 er den mest allestedsnærværende terminalelektronacceptor for pattedyrets ETC, anvendes dens reduktion som en proxy for mitokondriefunktion. Nye beviser viser imidlertid, at pattedyrs mitokondrier kan anvende fumarat som elektronacceptor til at opretholde mitokondriefunktioner, der afhænger af ETC, herunder de novo pyrimidinbiosyntese 7, NADH-oxidation7 og afgiftning af hydrogensulfid8. I visse sammenhænge, især i hypoxiske miljøer, giver målinger afO2-forbrugshastigheden (OCR) således ikke en præcis eller nøjagtig indikation af mitokondriefunktionen.
Her skitserer vi en række assays, der kan anvendes til at måle mitokondriefunktionen uafhængigt af OCR. Vi leverer analyser til direkte måling af kompleks I-medieret NADH-oxidation, dihydroorotat dehydrogenase-medieret de novo pyrimidinbiosyntese, kompleks V-afhængig ATP-syntese, nettoretningen af succinatdehydrogenasekomplekset (SDH) og mitokondrieafledt ROS. Disse analyser er beregnet til at blive udført på dyrkede pattedyrceller, selvom mange kan tilpasses til at studere mitokondriefunktioner in vivo. Især er analyserne beskrevet i denne protokol mere direkte målinger af mitokondriefunktioner end OCR. Desuden muliggør de måling af mitokondriefunktion i hypoxi, en sammenhæng, hvor OCR ikke er en vejledende måling. Samlet set vil disse analyser i kombination med klassiske respirometrieksperimenter give forskere en mere omfattende vurdering af mitokondriefunktionen i pattedyrceller.
Da ny forskning viser, at pattedyrs mitokondrier kan fungere uden at indtage molekylær ilt, er det yderst vigtigt for forskere at anvende ortogonale assays ud over OCR-målinger for nøjagtigt at kvantificere mitokondriefunktionen. Her udarbejdede vi en række assays, der kan bruges til direkte at vurdere aktiviteterne i kompleks I, kompleks II, kompleks V og DHODH ved at måle mitokondrie-NAD+/NADH-balancen, brugen af adaptive terminalelektronacceptorer, produktionen af ATP, de novo pyrimidinbiosyntese og mitokondrieafledt ROS. Især måler disse analyser mere direkte mitokondriefunktion end OCR-målinger. Desuden giver disse analyser forskere brugbare måder at kvantificere mitokondriefunktion under hypoxi, for hvilke OCR-målinger stort set er irrelevante på grund af fumarat, der anvendes som den foretrukne terminale elektronacceptor. Endelig er de spredningsbaserede metoder, der er beskrevet her, mere omkostningseffektive end klassiske respirometrieksperimenter, hvilket giver en bredt tilgængelig måde at studere mitokondriefunktion i pattedyrsystemer.
Der er vigtige overvejelser, når man bruger disse assays til at måle mitokondriefunktion i dyrkede celler. Med hensyn til proliferationsanalyserne er det vigtigt at justere antallet af celler, der er podet til fordoblingshastigheden for hver cellelinje. Cellerne skal podes til mindst 10% sammenløb og med tilstrækkelig plads til at tillade tre til fire fordoblinger, så forskelle i spredning kan kvantificeres. En anden overvejelse for hvert assay er koncentrationen af de små molekyler, der anvendes som kontroller for aktiviteterne i hvert ETC-kompleks. Da forskellige cellelinjer kan udvise forskellig følsomhed over for disse hæmmere, er det afgørende at teste dosis af disse små molekyler for at identificere den optimale koncentration.
En universel begrænsning af assays, der studerer mitokondriefunktion in vitro, herunder OCR-målinger og alle de analyser, der er beskrevet her, er dyrkningsmediets metaboliske sammensætning. Standard cellekulturmedium har tendens til at bias systemer til overfladisk høje niveauer af mitokondriefunktion. For eksempel øger suprafysiologiske glutaminniveauer dets anaplerose af TCA-cyklussen25, hvilket brænder mitokondriel NADH-syntese og følgelig øger oxidativ phosphorylering. Tilsvarende varierer partialtrykket af ilt mellem 3 mmHg og 100 mmHg (ca. 0,1% -13%O2) i pattedyrvæv, men er atmosfærisk (140 mmHg, ca. 21%) in vitro26,27. Dette overskudO2 maksimerer mitokondriel åndedrætskapacitet og superoxidproduktion28. For nylig er der gjort en indsats for at designe kulturmedier til at være mere fysiologiske29,30. Især reducerer dyrkning af celler i humane plasmalignende medier mitokondriel respiration i nogle kræftcellelinjer30, mitokondriel ROS i T-celler 31 og mitokondrietilpasninger til kræftterapi32. Det er derfor afgørende at være opmærksom på sammensætningen af de kulturmedier, der bruges, og forstå, hvordan det kan påvirke mitokondriefunktionen.
En anden vigtig og universel begrænsning i fortolkningen af mitokondriefunktionen er potentialet for forskelle i antallet af mitokondrier. Det er derfor afgørende at måle mitokondrieindholdet gennem enten kvantificering af mtDNA33, måling af mitokondriemasse med membranpotentiale-ufølsomme farvestoffer34 eller western blotting af mitokondriemarkører. Dette er en kritisk kontrol, så et fald i antallet af mitokondrier ikke forveksles med et fald i mitokondriefunktionen.
Der er også specifikke begrænsninger og fejlfinding, der gælder for de analyser, der er beskrevet her. For det første, da differentierede celler ikke formerer sig, vil de proliferationsbaserede assays ikke være nyttige til vurdering af mitokondriefunktion i denne sammenhæng. En vigtig begrænsning af 13C 4-aspartatsporingsprotokollen til måling af DHODH-aktivitet er, at aspartatoptagelse i celler kan være ekstremt ineffektiv35. For at overvinde denne potentielle begrænsning kan forskere overudtrykke aspartattransportøren, SLC1A3, for at lette 13C 4-aspartatoptagelse35.
En begrænsning af protokollen, der bruger 13C 5-glutaminsporing til måling af SDH-aktivitet, er, at dette assay kræver, at celler bruger den reduktive carboxyleringsvej til at berige M + 3-isotopologerne for at måle den omvendte aktivitet. Nogle cellelinjer er ude af stand til reduktiv carboxyleringsflux på grund af lav ATP-citratlyaseekspression36, utilstrækkelig HIF-stabilisering 37 eller et α-KG: citratforhold, der er for lavt38. For at overvinde denne begrænsning kunne man bruge 13C 4-aspartat sporing til at måle SDH fremad og tilbageaktiviteter 7. I dette assay kan SDH-fremadgående aktivitet måles ved forholdet mellem fumarat M+2:succinat M+2 og den omvendte reaktion ved succinat M+4:fumarat M+4. Især omgår denne sporing de fleste enzymer i den reduktive carboxyleringsvej.
En begrænsning af det komplekse I-aktivitetsassay ved hjælp af DCPIP-reduktion som aflæsning er, at mitokondrierne ikke er strukturelt intakte. Processen med at fryse-optø mitokondrierne for at muliggøre deres NADH-optagelse til analysen kan helt sikkert plette mitokondriemembranens strukturelle integritet39. Dette assay bør udføres parallelt med assays såsom det komplekse I-proliferationsassay for at sikre, at de observerede ændringer i kompleks I-aktivitet også gælder for intakte celler.
I fremtidige undersøgelser kan nogle af disse teknikker tilpasses til måling af mitokondriefunktioner in vivo ved hjælp af modelorganismer som mus og Caenorhabditis elegans. De nuværende metoder, der anvendes til at måle mitokondriefunktionen in vivo, er centreret om OCR på organismeniveau, specifikt respirationsudvekslingshastigheden ved brug af musemodeller. En klar begrænsning af denne metode er, at ilt tjener mange biokemiske og signalfunktioner ud over sin rolle som en allestedsnærværende terminal elektronacceptor i mitokondriet ETC. For eksempel “forbruges” ilt af den katalytiske aktivitet af enzymer i dioxygenasefamilien. Selvom disse enzymer bidrager til den cellulære iltforbrugshastighed, deltager de ikke i, regulerer eller afspejler mitokondriefunktionen. Klassiske respirometriforsøg in vitro kontrollerer typisk for “ikke-mitokondriel OCR”, mens organismal respiratory exchange ratio (RER) eksperimenter ikke kan kontrollere for dette, hvilket begrænser fortolkningen af RER som en metrisk for mitokondriefunktion in vivo. Det er dog muligt at tilpasse protokollerne til at måle DHODH-aktivitet via 13 C 4-aspartatsporing, kompleks II-aktivitet via 13C5-glutaminsporing, kompleks I-aktivitet på mitokondrier renset fra væv og mitokondriel ROS ved hjælp af LC-MS-venlige forbindelser såsom MitoB for at måle mitokondriefunktion in vivo . Disse direkte analyser til at forhøre mitokondriefunktioner i kombination med klassiske respirometrieksperimenter giver forskere en mere omfattende og nøjagtig vurdering af mitokondriefunktionen i pattedyrceller og væv.
The authors have nothing to disclose.
Figurerne produceret i dette manuskript blev skabt med BioRender.com. Vi er taknemmelige for, at Amy Walker giver feedback på denne artikel. J.B.S. blev støttet af Worcester Foundation for Biomedical Research Grant.
1.5 mL tube | Cell Treat | 667443 | |
2.0 mL tube | Cell Treat | 229446 | |
6-well plate | Cell Treat | 229106 | |
12-well plate | Cell Treat | 229112 | |
13C4-aspartate | Sigma-Aldrich | 604852 | |
13C5-Glutamine | Cambridge Isotope Laboratories | 285978-14-5 | |
15 mL centrifuge tube | Cell Treat | 667411 | |
50 mL centrifuge tube | Cell Treat | 667421 | |
150 mm tissue culture dish | Cell Treat | 229651 | |
1x Phosphate-buffered saline | Gibco | 10010049 | |
2,6-dichlorophenolindophenol | Honeywell | 33125 | |
Ammonium Carbonate | Sigma-Aldrich | 37999 | |
Antimycin | Sigma-Aldrich | A8674 | |
Ascentis Express C18 | Sigma-Aldrich | 53825-U | |
Bottle top filter 500 mL, 0.22 µm, PES 9 9 mm membrane diameter | Cell Treat | 229717 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
Brequinar | Sigma-Aldrich | SML0113 | |
Cell Lifter, Double End Flat and Narrow Blade | Cell Treat | 229305 | |
CentriVap -105 Cold Trap | Labconco | 7385020 | |
Complete Protease Inhibitor Tablets | Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
Coulter Counter Cups | Fisher Scientific | 07-000-694 | |
Decylubiquinone | Sigma-Aldrich | D7911 | |
DMSO | Invitrogen | D12345 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Eppendorf Centrifuge 5425R | Eppendorf | 2231000908 | |
Eppendorf Centrifuge 5910 Ri | Eppendorf | 5943000343 | |
Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
Glucose-free DMEM | Gibco | 11966025 | |
Glutamine-free DMEM | Thermo Fisher | 11960044 | |
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
HPLC-grade 35% Ammonium hydroxide | Thermo Scientific | 460801000 | |
HPLC-grade Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 900667 | |
HPLC-grade Chloroform | Sigma-Aldrich | 366927 | |
HPLC-grade formic acid | Thermo Scientific | 28905 | |
HPLC-grade Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935 | |
HPLC-grade MeOH | Sigma-Aldrich | 900688 | |
HPLC-grade Water | Sigma-Aldrich | 270733 | |
Human Osteosarcome Cell Line 143B | ATCC | CRL-8303 | |
Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 320331-500ML | |
Isotone buffer | Beckman Coulter | 8546719 | |
K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P2222 | |
Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
MitoSox Red | Invitrogen | M36008 | |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
Pencillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Potter-Elvehjem Tissue Grinder, Size 21 | Kimble | 885502-0021 | |
Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
Pyruvate-free DMEM media | Gibco | 11965175 | |
Q Exactive Plus Mass Spectrometer | Thermo Scientific | 726030 | |
ReCO2ver Incubator | Baker | ||
Refrigerated Centrivap Benchtop Vacuum Concentrator | Labconco | 7310020 | |
RIPA Buffer | Millipore Sigma | 20188 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
SeQuant ZIC-pHILIC 5μm 150 x 2.1 mm analytical column | Sigma-Aldrich | 1.50460.0001 | |
SeQuant ZIC-pHILIC guard kit | Millipore Sigma | 1.50438.0001 | |
Sodium Hydroxide, Pellets | Millipore Sigma | 567530-250GM | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
SW, TRACEFINDER 5.1 SP3 | Thermo Scientific | OPTON-31001 | |
Tert-butyl hydroperoxide solution | Sigma-Aldrich | 458139 | |
Tris | Sigma-Aldrich | 93352 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25-200-114 | |
Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | |
VANQUISH HORIZON / FLEX HPLC | Thermo Scientific | VF-S01-A-02 | |
Z2 Coulter Particle count and size analyzer | Beckman Coulter | BZ10131270 |