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Ricerca sul cancro

がん細胞株を用いた伝達性サイブリッドの作製

Published: March 17, 2023
doi:
10.3791/65186
, , , , ,
1Department of Biochemistry,University of Zaragoza, 2Institute for Biocomputation and Physics of Complex Systems,University of Zaragoza, 3Sequencing and Functional Genomics Unit,University of Zaragoza-IACS

Summary

このプロトコルは、腫瘍形成プロセスにおけるミトコンドリアの役割を研究するためのツールとして、浮遊増殖癌細胞からサイブリッドを生成するための技術について説明しています。

Abstract

近年、ミトコンドリアと癌の関係を確認することに専念する研究の数が大幅に増加しています。しかし、ミトコンドリアと腫瘍形成の変化を含む関連を完全に理解し、腫瘍関連のミトコンドリア表現型を特定するには、さらに多くの努力が必要です。例えば、腫瘍形成および転移過程におけるミトコンドリアの寄与を評価するためには、異なる核環境における腫瘍細胞からのミトコンドリアの影響を理解することが不可欠です。この目的のために、1つの可能なアプローチは、いわゆるサイブリッド細胞を得るためにミトコンドリアを異なる核の背景に移すことからなる。従来のサイブリダイゼーション技術では、mtDNA(ρ0、核ドナー細胞)を欠く細胞株に、除核細胞または血小板のいずれかに由来するミトコンドリアが再移植されます。しかしながら、除核プロセスは培養プレートへの良好な細胞接着を必要とし、浸潤性細胞では多くの場合部分的または完全に失われる特徴である。さらに、従来の方法に見られる別の困難は、ミトコンドリアレシピエント細胞株から内因性mtDNAを完全に除去して、純粋な核およびミトコンドリアDNAバックグラウンドを取得し、生成されたサイブリッドに2つの異なるmtDNA種が存在することを回避することです。この研究では、単離されたミトコンドリアを用いたローダミン6G前処理細胞の再増殖に基づいて、浮遊増殖癌細胞に適用されるミトコンドリア交換プロトコルを提示します。この方法論は、従来のアプローチの限界を克服することを可能にし、したがって、癌の進行および転移におけるミトコンドリアの役割の理解を拡大するためのツールとして使用することができる。

Introduction

エネルギー代謝の再プログラミングは、1930年代にオットー・ウォーバーグによって初めて観察された癌1の特徴です2。好気性条件下では、正常細胞はグルコースをピルビン酸に変換し、それがアセチルCoAを生成し、ミトコンドリア機構に燃料を供給し、細胞呼吸を促進します。それにもかかわらず、Warburgは、正常酸素条件下でも、ほとんどの癌細胞が解糖プロセスから得られたピルビン酸を乳酸に変換し、エネルギーを得る方法を変えることを実証しました。この代謝調節は「ウォーバーグ効果」として知られており、好気性プロセスよりもATPの生成効率が低いにもかかわらず、一部の癌細胞が急速な成長と分裂に対するエネルギー的な要求を満たすことを可能にします3,4,5。ここ数十年で、多くの研究が癌の進行における代謝再プログラミングの意味を支持してきました。したがって、腫瘍エネルギー論は癌に対する興味深い標的と考えられています1。エネルギー代謝と必須前駆体の供給の中心的なハブとして、ミトコンドリアはこれらの細胞適応において重要な役割を果たしていますが、今日まで部分的にしか理解されていません。

上記に沿って、ミトコンドリアDNA(mtDNA)変異は、この代謝リプログラミングの考えられる原因の1つとして提案されており、電子伝達系(ETC)のパフォーマンスの低下につながる可能性があり6、一部の癌細胞が解糖系代謝を増強して生き残る理由を説明します。実際、mtDNAは癌細胞内に突然変異を蓄積し、腫瘍の少なくとも50%に存在することが報告されています7。たとえば、Yuanらが実施した最近の研究では、腎臓がん、結腸直腸がん、甲状腺がんにハイパー変異および切断されたmtDNA分子が存在することが報告されています8。さらに、多くの研究は、特定のmtDNA変異がより攻撃的な腫瘍表現型および癌細胞の転移能の増加と関連していることを実証している9,10,11,12,13,14,15,16。

癌の進行におけるミトコンドリアゲノムの明らかな関連性にもかかわらず、これらの突然変異の研究と疾患への寄与は、現在利用可能な実験モデルと技術の限界のために困難でした17。したがって、がん疾患の発症と進行におけるミトコンドリアDNAの実際の影響を理解するための新しい技術が必要です。この研究では、従来のシブリダイゼーション法の主な課題を克服する、単離されたミトコンドリアを用いたローダミン6G前処理細胞の再増殖に基づいて、浮遊増殖癌細胞からの伝達軟骨サイブリッド生成のためのプロトコルを紹介します18,19。この方法論は、対応するρ0細胞株の利用可能性や、従来の技術では除核が困難な細胞(すなわち、非接着性細胞株)からのミトコンドリアの移入に関係なく、任意の核ドナーの使用を可能にします。

Protocol

注:すべての培地およびバッファー組成は 表1に規定されています。サイブリッドの生成前に、ドナー細胞とレシピエント細胞からのミトコンドリアDNAプロファイルと核DNAプロファイルの両方を入力して、細胞株間の両方のゲノムに遺伝的差異が存在することを確認する必要があります。本研究では、当研究室で自発的に作製した市販のL929細胞株とその由来細胞株L929dt(詳細は<sup c…

Representative Results

上記のプロトコルに従った後、 図1 および図2の概略 図に示されているように、保存された核背景を有するが新しいミトコンドリア遺伝子型を有するホモプラズムサイブリッド細胞株が得られるはずである。サイブリッドに存在するミトコンドリアおよび核DNAの純度は、図 3に示すようにRFLPによって、および ?…

Discussion

Otto Warburgが、がん細胞が代謝をシフトさせ、ミトコンドリア呼吸を減少させながら「好気性解糖」3,4を増強することを報告して以来、がんの形質転換と進行におけるミトコンドリアの役割への関心は指数関数的に高まっています。近年、mtDNAの変異とミトコンドリア機能障害が、多くの癌型の特徴として仮定されています25。現在?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

本研究は、RSA、JMB、AAには助成金番号PID2019-105128RB-I00、PFSおよびRMLにはPGC2018-095795-B-I00の資金提供を受け、どちらもMCIN/AEI/10.13039/501100011033から資金提供を受け、助成金番号B31_20R(RSA、JMA、AA)およびE35_17R(PFSおよびRML)から資金提供を受け、Gobierno de Aragónから資金提供を受けました。RSAの活動は、アソシアシオン・エスパニョーラ・コントラ・エル・カンセル(AECC)PRDAR21487SOLEからの助成金によって支援されました。著者らは、サラゴサ大学のServicio General de Apoyo a la Investigación-SAIの使用を認めたいと思います。

Materials

3500XL Genetic Analyzer  ThermoFisher Scientific 4406016
6-well plate Corning 08-772-1B
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit ThermoFisher Scientific 4427368
Anode Buffer Container 3500 Series Applied Biosystems 4393927
Boric acid PanReac 131015
Bradford assay Biorad 5000002
Cathode Buffer Container 3500 Series Applied Biosystems 4408256
Cell culture flasks TPP 90076
DMEM high glucose Gibco 11965092
EDTA PanReac 131026
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E8751
Geneticin Gibco 10131027
Homogenizer Teflon pestle Deltalab 196102
L929 cell line ATCC CCL-1
MiniProtean Tetra4 Gel System BioRad 1658004
MOPS Sigma-Aldrich M1254
PCR primers Sigma-Aldrich Custom products
Polyacrylamide Solution 30% PanReac A3626
Polyethylene glycol Sigma-Aldrich P7181
POP-7 Applied Biosystems 4393714
Pyruvate Sigma-Aldrich P5280
QIAmp DNA Mini Kit Qiagen 51306
Rhodamine-6G Sigma-Aldrich R4127
Serum Fetal Bovine Sigma-Aldrich F7524
SspI New England Biolabs R3132
Streptomycin/penicillin PAN biotech P06-07100
Sucrose Sigma-Aldrich S3089
TEMED Sigma-Aldrich T9281
Tris PanReac P14030b
Uridine Sigma-Aldrich U3750
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Soler-Agesta, R., Marco-Brualla, J., Fernández-Silva, P., Mozas, P., Anel, A., Moreno Loshuertos, R. Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines. J. Vis. Exp. (193), e65186, doi:10.3791/65186 (2023).
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