कैंसर सेल लाइनों का उपयोग करके ट्रांसमाइटोकॉन्ड्रियल साइब्रिड पीढ़ी
Summary
यह प्रोटोकॉल ट्यूमरोजेनिक प्रक्रिया में माइटोकॉन्ड्रिया की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में निलंबन-बढ़ती कैंसर कोशिकाओं से साइब्रिड पीढ़ी के लिए एक तकनीक का वर्णन करता है।
Abstract
हाल के वर्षों में, माइटोकॉन्ड्रिया और कैंसर के बीच संबंध का पता लगाने के लिए समर्पित अध्ययनों की संख्या में काफी वृद्धि हुई है। हालांकि, माइटोकॉन्ड्रिया और ट्यूमरजेनिसिस में परिवर्तन से जुड़े लिंक को पूरी तरह से समझने के साथ-साथ ट्यूमर से जुड़े माइटोकॉन्ड्रियल फेनोटाइप की पहचान करने के लिए अभी भी अधिक प्रयासों की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, ट्यूमरजेनिसिस और मेटास्टेसिस प्रक्रियाओं में माइटोकॉन्ड्रिया के योगदान का मूल्यांकन करने के लिए, विभिन्न परमाणु वातावरण में ट्यूमर कोशिकाओं से माइटोकॉन्ड्रिया के प्रभाव को समझना आवश्यक है। इस उद्देश्य के लिए, एक संभावित दृष्टिकोण में तथाकथित साइब्रिड कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया को एक अलग परमाणु पृष्ठभूमि में स्थानांतरित करना शामिल है। पारंपरिक साइब्रिडाइजेशन तकनीकों में, एमटीडीएनए की कमी वाली एक सेल लाइन (0, परमाणु दाता सेल) को या तो एन्यूक्लियेटेड कोशिकाओं या प्लेटलेट्स से प्राप्त माइटोकॉन्ड्रिया के साथ फिर से आबाद किया जाता है। हालांकि, न्यूक्लियेशन प्रक्रिया को कल्चर प्लेट में अच्छे सेल आसंजन की आवश्यकता होती है, एक विशेषता जो आक्रामक कोशिकाओं में कई मामलों में आंशिक रूप से या पूरी तरह से खो जाती है। इसके अलावा, पारंपरिक तरीकों में पाई जाने वाली एक और कठिनाई शुद्ध परमाणु और माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए पृष्ठभूमि प्राप्त करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल-प्राप्तकर्ता सेल लाइन से अंतर्जात एमटीडीएनए को पूरी तरह से हटाने को प्राप्त कर रही है, जिससे उत्पन्न साइब्रिड में दो अलग-अलग एमटीडीएनए प्रजातियों की उपस्थिति से बचा जा सकता है। इस काम में, हम एक माइटोकॉन्ड्रियल एक्सचेंज प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के साथ रोडामाइन 6 जी-प्रीट्रीटेड कोशिकाओं के पुनर्जनन के आधार पर निलंबन-बढ़ती कैंसर कोशिकाओं पर लागू होता है। यह पद्धति हमें पारंपरिक दृष्टिकोणों की सीमाओं को दूर करने की अनुमति देती है, और इस प्रकार कैंसर की प्रगति और मेटास्टेसिस में माइटोकॉन्ड्रियल भूमिका की समझ का विस्तार करने के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
ऊर्जा चयापचय को पुन: प्रोग्राम करना कैंसर1 की एक पहचान है जिसे 1930के दशक में ओटो वारबर्ग द्वारा पहली बार देखा गया था। एरोबिक परिस्थितियों में, सामान्य कोशिकाएं ग्लूकोज को पाइरूवेट में परिवर्तित करती हैं, जो तब एसिटाइल-सीओए उत्पन्न करती हैं, माइटोकॉन्ड्रियल मशीनरी को ईंधन देती हैं और सेलुलर श्वसन को बढ़ावा देती हैं। फिर भी, वारबर्ग ने प्रदर्शित किया कि, नॉर्मोक्सिक स्थितियों के तहत भी, अधिकांश कैंसर कोशिकाएं ग्लाइकोलाइसिस प्रक्रिया से प्राप्त पाइरूवेट को लैक्टेट में परिवर्तित करती हैं, ऊर्जा प्राप्त करने के लिए अपना रास्ता बदलती हैं। इस चयापचय समायोजन को “वारबर्ग प्रभाव” के रूप में जाना जाता है और कुछ कैंसर कोशिकाओं को एरोबिक प्रक्रिया 3,4,5 की तुलना में एटीपी कम कुशलता से उत्पन्न करने के बावजूद, तेजी से विकास और विभाजन के लिए अपनी ऊर्जावान मांगों की आपूर्ति करने में सक्षम बनाता है। हाल के दशकों में, कई कार्यों ने कैंसर की प्रगति में चयापचय रीप्रोग्रामिंग के निहितार्थ का समर्थन किया है। इसलिए, ट्यूमर ऊर्जावान को कैंसर1 के खिलाफ एक दिलचस्प लक्ष्य माना जाता है। ऊर्जावान चयापचय में और आवश्यक अग्रदूतों की आपूर्ति में एक केंद्रीय केंद्र के रूप में, माइटोकॉन्ड्रिया इन सेल अनुकूलन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जो आज तक, हम केवल आंशिक रूप से समझते हैं।
उपरोक्त के अनुरूप, माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए (एमटीडीएनए) उत्परिवर्तन को इस चयापचय रीप्रोग्रामिंग के संभावित कारणों में से एक के रूप में प्रस्तावित किया गया है, जिससे बिगड़ा हुआ इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ईटीसी) प्रदर्शन6 हो सकता है और यह बताएगा कि कुछ कैंसर कोशिकाएं जीवित रहने के लिए अपने ग्लाइकोलाइटिक चयापचय को क्यों बढ़ाती हैं। दरअसल, यह बताया गया है कि एमटीडीएनए कैंसर कोशिकाओं के भीतर उत्परिवर्तन जमा करता है, कम से कम 50% ट्यूमर7 में मौजूद होता है। उदाहरण के लिए, युआन एट अल द्वारा किए गए एक हालिया अध्ययन ने गुर्दे, कोलोरेक्टल और थायराइड कैंसर में हाइपरम्यूटेड और कटे हुए एमटीडीएनए अणुओं कीउपस्थिति की सूचना दी। इसके अलावा, कई कार्यों से पता चला है कि कुछ एमटीडीएनए उत्परिवर्तन अधिक आक्रामक ट्यूमर फेनोटाइप से जुड़े हैं और कैंसर कोशिकाओं की मेटास्टैटिक क्षमता में वृद्धि के साथ 9,10,11,12,13,14,15,16 हैं।
कैंसर की प्रगति में माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम की स्पष्ट प्रासंगिकता के बावजूद, इन उत्परिवर्तनों का अध्ययन और रोग में उनका योगदान वर्तमानमें उपलब्ध प्रयोगात्मक मॉडल और प्रौद्योगिकियों में सीमाओं के कारण चुनौतीपूर्ण रहा है। इस प्रकार, कैंसर रोग के विकास और प्रगति में माइटोकॉन्ड्रिया डीएनए के वास्तविक प्रभाव को समझने के लिए नई तकनीकों की आवश्यकता है। इस काम में, हम निलंबन-बढ़ते कैंसर कोशिकाओं से ट्रांसमाइटोकॉन्ड्रियल साइब्रिड पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जो पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के साथ रोडामाइन 6 जी-प्रीट्रीटेड कोशिकाओं की पुनरावृत्ति पर आधारित है, जो पारंपरिक साइब्रिडाइजेशन विधियों18,19 की मुख्य चुनौतियों को दूर करता है। यह पद्धति किसी भी नाभिक दाता के उपयोग की अनुमति देती है, भले ही उनकी संबंधित 0 सेल लाइन की उपलब्धता और कोशिकाओं से माइटोकॉन्ड्रिया का हस्तांतरण हो, जो पारंपरिक तकनीकों का पालन करते हुए, एन्यूक्लियेट करना मुश्किल होगा (यानी, गैर-अनुयायीसेल लाइनें)।
Protocol
Representative Results
Discussion
चूंकि ओटो वारबर्ग ने बताया कि कैंसर कोशिकाएं अपने चयापचय को स्थानांतरित करती हैं और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को कम करते हुए “एरोबिक ग्लाइकोलाइसिस” 3,4 को शक्तिशाली बनाती हैं, इसलिए क…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को आरएसए, जेएमबी और एए को अनुदान संख्या PID2019-105128आरबी-आई00 और पीएफएस और आरएमएल को PGC2018-095795-बी-आई00 द्वारा वित्त पोषित किया गया था, दोनों एमसीआईएन / एईआई / 10.13039 / 501100011033 और अनुदान संख्या B31_20R (आरएसए, जेएमए, और एए) और E35_17R (पीएफएस और आरएमएल) द्वारा वित्त पोषित और गोबिर्नो डी अरागॉन द्वारा वित्त पोषित थे। आरएसए के काम को एसोसिओन एस्पानोला कॉन्ट्रा एल कैंसर (एईसीसी) PRDAR21487SOLE से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक सर्विसियो जनरल डी एपोयो ए ला इन्वेस्टिगासियोन-एसएआई, यूनिवर्सिड डी ज़ारागोज़ा के उपयोग को स्वीकार करना चाहते हैं।
Materials
| 3500XL Genetic Analyzer | ThermoFisher Scientific | 4406016 | |
| 6-well plate | Corning | 08-772-1B | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit | ThermoFisher Scientific | 4427368 | |
| Anode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4393927 | |
| Boric acid | PanReac | 131015 | |
| Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
| Cathode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4408256 | |
| Cell culture flasks | TPP | 90076 | |
| DMEM high glucose | Gibco | 11965092 | |
| EDTA | PanReac | 131026 | |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E8751 | |
| Geneticin | Gibco | 10131027 | |
| Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
| L929 cell line | ATCC | CCL-1 | |
| MiniProtean Tetra4 Gel System | BioRad | 1658004 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| PCR primers | Sigma-Aldrich | Custom products | |
| Polyacrylamide Solution 30% | PanReac | A3626 | |
| Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| POP-7 | Applied Biosystems | 4393714 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| QIAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51306 | |
| Rhodamine-6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Serum Fetal Bovine | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| SspI | New England Biolabs | R3132 | |
| Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris | PanReac | P14030b | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 |
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