Et antimikrobielt stoff ved hjelp av nano-urteinnkapsling av essensielle oljer

Summary

Antimikrobielle laboratoriefrakker forhindrer krysskontaminering av patogenakkumulering og utilsiktet bioutslipp. Her beskriver vi protokollen for å utvikle et hudvennlig antimikrobielt stoff ved hjelp av nano-urteinnkapsling og modifiserte standardtester for å nøyaktig evaluere effekten og egnetheten for typisk bruk av laboratoriebelegget.

Abstract

Laboratoriefrakker er mye brukt i biohazard laboratorier og helseinstitusjoner som beskyttende plagg for å forhindre direkte eksponering for patogener, søl og brannskader. Disse bomullsbaserte beskyttelsesfrakkene gir ideelle forhold for mikrobiell vekst og festesteder på grunn av deres porøse natur, fuktighetsholdende kapasitet og oppbevaring av varme fra brukerens kropp. Flere studier har vist overlevelse av patogene bakterier på sykehusklær og laboratoriefrakker, som fungerer som vektorer for mikrobiell overføring.

En vanlig tilnærming for å løse disse problemene er anvendelsen av antimikrobielle midler i tekstilbehandling, men bekymringer har blitt reist på grunn av toksisitet og miljøeffekter av mange syntetiske kjemikalier. Den pågående pandemien har også åpnet et vindu for undersøkelse av effektive antimikrobielle stoffer og miljøvennlige og toksisfrie formuleringer. Denne studien bruker to naturlige bioaktive forbindelser, karvacrol og tymol, innkapslet i kitosan nanopartikler, som garanterer effektiv beskyttelse mot fire humane patogener med opptil 4-log reduksjon (99, 99%). Disse patogenene oppdages ofte i laboratoriefrakker som brukes i biohazard-laboratorier.

De behandlede stoffene motsto også opptil 10 vaskesykluser med 90 % mikrobiell reduksjon, noe som er tilstrekkelig for tiltenkt bruk. Vi har gjort endringer i de eksisterende standard stofftestene for bedre å representere de typiske scenariene for bruk av laboratoriefrakk. Disse forbedringene muliggjør en mer nøyaktig evaluering av effektiviteten av antimikrobielle laboratoriefrakker og for simulering av skjebnen til eventuelle utilsiktede mikrobielle utslipp som må nøytraliseres innen kort tid. Videre studier anbefales for å undersøke akkumulering av patogener over tid på antimikrobielle laboratoriefrakker sammenlignet med vanlige beskyttelsesfrakker.

Introduction

Den beskyttende hvite pelsen er et obligatorisk personlig verneutstyr (PPE) i mikrobiologiske laboratorier og helseinstitusjoner, og den beskytter mot direkte eksponering for patogener, søl og brannskader. Disse bomullsfrakkene fremmer mikrobiell vekst på grunn av mange faktorer – det vevde stoffet gir festesteder og lufting, bomull og stivelse som brukes i produksjonsprosessen sammen med eksfolierte epitelceller fra brukerforsyningen næringsstoffer, og nærheten til brukeren gir varme og fuktighet. Akkumulering av mikrober på tekstiler kan også forårsake helseproblemer som allergi og nosokomial infeksjon, ubehagelig lukt og stoffforringelse¹.

I motsetning til vanlige klær, blir beskyttelsesfrakker sjelden vasket eller desinfisert, som funnet i mange undersøkelser ^2,3. Mange studier viser tegn på laboratoriefrakker som fungerer som en vektor for mikrobiell overføring og risikoen for nosokomiale infeksjoner i helsevesenet^2,4, spesielt resistente stammer³ som meticillinresistente Staphylococcus aureus (MRSA); Dermed reiser de helseproblemer av PPE, som er ment å beskytte mot mikrobiell forurensning. Det er ikke nok tverrsnittsstudier på laboratoriebeleggassosierte infeksjoner i sammenheng med Biosafety Level 2 (BSL-2) fasiliteter eller mikrobiologiske undervisningslaboratorier, men mange reguleringsmyndigheter begrenser bruken av laboratoriefrakker innenfor inneslutningsnivået. Imidlertid sliter mange akademiske institusjoner i Nord-Amerika med å oppfylle kravene på grunn av praktiske begrensninger, for eksempel hvitvasking og lagring inne i anlegget, hendelsene med å bruke laboratoriefrakker i offentlige områder som kafeteriaer og biblioteker er vanlige. En praktisk løsning på disse problemene er anvendelsen av antimikrobielle midler i tekstilbehandling.

Antimikrobielle stoffer blir stadig mer populære i sportsklær, aktivklær og sokker, hovedsakelig ment å redusere kroppslukt. Bruken av disse stoffene er imidlertid ikke vanlig i PPE-utvikling, bortsett fra noen sølvbelagte bomullsmasker og helseplagg⁵. Vi rapporterer utviklingen av et antimikrobielt stoff for laboratoriebelegg, som hemmer vanlige patogener som finnes i BSL-2-laboratorier og gir effektiv beskyttelse mot krysskontaminering av vanlige patogener.

For tiden er en rekke antimikrobielle stoffer og etterbehandlinger tilgjengelige i markedet, men de fleste av disse bruker tungmetallkolloidale partikler (f.eks. Sølv, kobber, sink), organometallikk eller syntetiske kjemikalier som triclosan og kvaternære ammoniumforbindelser, som ikke er miljøvennlige¹ og kan føre til helseproblemer som hudirritasjon og allergi⁶. Noen syntetiske formuleringer utgjør bekymringer på grunn av ikke-målmikrober, for eksempel normal flora eller indusering av antimikrobiell resistens (AMR). US Food and Drug Administration (FDA) regulerer kommersielle antimikrobielle stoffer, som må være giftfri for brukeren og fri for økotoksisitet. Derfor er antimikrobielle stoffer basert på naturlige biocider som hemmer et bredt spekter av mikrober å foretrekke. Eteriske oljer (EOer) brukes mye som antimikrobielle og terapeutiske midler, men deres bruk i antimikrobiell etterbehandling er begrenset på grunn av deres holdbarhet ^6,7,8. Basert på vår kunnskap og markedsundersøkelser om nano-urte etterbehandling⁸, er ingen urtebaserte antimikrobielle stoffer kommersielt tilgjengelig. Dette skyldes at syntetiske belegg er enkle å produsere og har lang holdbarhet. Noen nano-urtebelagte tekstiler som kun rapporteres for forskningsformål, inkluderer neem⁷, moringa 9 og karriblader⁹.

Den nåværende studien bruker to bioaktive komponenter ekstrahert fra oregano EOer, karvacrol og tymol, som er effektive mot et bredt spekter av bakterielle patogener og virus, men er generelt anerkjent som trygge for mennesker. Imidlertid er disse bioaktive komponentene flyktige, og derfor er deres antimikrobielle potensial kortvarig hvis de påføres direkte på stoffet. Nano-urte innkapsling er en prosess der bioaktive komponenter eller legemidler lastes inn i et polymert skall som beskytter kjernen mot miljøforringelse, og dermed forbedrer holdbarheten. I tillegg øker den lille størrelsen på polymerpartiklene, som vanligvis varierer fra 10 nm til 100 nm, effektiviteten av applikasjonen og bremser frigjøringen av de bioaktive forbindelsene på stoffet. Disse bioaktive forbindelsene brukes til forskjellige formål, for eksempel konservering^{av mat 10}, men ikke for tekstilbelegg.

Blant mange polymere innkapslingsmidler er kitosan en attraktiv kandidat på grunn av mange av dens egenskaper, som ikke-toksisitet, biologisk nedbrytbarhet, mukoadhesivitet og biokompatibilitet¹¹. Det er et naturlig polysakkarid, oppnådd ved deacetyleringsprosessen fra kitin, som finnes i skjell og soppcellevegger. Den brukes i biokjemiske og matkonserveringsapplikasjoner som legemiddel- eller proteinlevering 11,12,13^, kontrollert frigjøring 14 og antimikrobielle filmer ¹⁰. Chitosan er ikke lett løselig i vann, men danner en kolloidal suspensjon i sure medier. Bioaktive molekyler lastes inn i kitosan nanopartikler (NP) ved en enkel to-trinns ionisk geleringsmetode^14,15,16. I denne prosessen danner hydrofobe bioaktive forbindelser som karvacrol og tymol en olje-i-vann-emulsjon, som støttes av et overflateaktivt middel, Tween 80. Deretter brukes en polyanionisk forbindelse, pentasodiumtripolyfosfat (TPP), til å danne tverrbindingene mellom aminogruppene langs polykationiske polymermolekyler og fosfatgrupper av TPP-molekyler for å stabilisere komplekset. Denne kompleksiseringsprosessen størkner de bioaktive forbindelsene i matrisen av kitosan, som deretter renses og belegges på bomullsprøver for å produsere antimikrobielt stoff.

Nano-formuleringene må først testes for antimikrobiell effektivitet i emulsjonsform før de påføres stoffet. Dette kan enkelt evalueres ved en kvalitativ metode, for eksempel Kirby-Bauer diskdiffusjon, brønndiffusjon, og sylinderplateanalysen. Imidlertid gir sylinderplateanalysen¹⁷ fleksibiliteten til å laste varierende volumer av formuleringen og sammenligne klaringssonen. I denne metoden lastes de antimikrobielle formuleringene i rustfritt stål sylindere og plasseres på et mykt agarlag, som inokuleres med testmikroorganismen eller patogenet. Diameteren av clearancesonen produsert mot testorganismen er proporsjonal med det hemmende potensialet til den antimikrobielle formuleringen, og kan derfor brukes som et alternativ til buljongfortynningsmetoder. Størrelsen på de klare sonene er imidlertid bare et komparativt eller kvalitativt mål innenfor en bestemt plate med mindre spesifikke standarder opprettholdes. Antimikrobielle midler virker mot patogenene enten ved å hemme deres vekst (biostatisk) eller drepe cellene (biocidal), som kan kvantifiseres ved henholdsvis minimum hemmende konsentrasjon (MIC) og minimum bakteriedrepende konsentrasjon (MBC). Imidlertid er effekten og oppførselen til de bioaktive kjemikaliene forskjellige i deres formuleringer (flytende tilstand) og når de er belagt på et substrat som et stoff¹⁸. Dette skyldes at flere faktorer spiller en rolle i effekten, for eksempel stabiliteten av adherens av antimikrobielle midler til stoffet, fuktighetsinnhold, substrattype og overholdelse av mikrober. Hvis det tiltenkte formålet bare er bakteriostatisk aktivitet, kan en kvalitativ analyse som “Parallel Streak Method”¹⁹ gi en relativt rask og enkel evaluering av diffusibel antimikrobiell formulering. Imidlertid, hvis de bakteriedrepende effektene skal bestemmes, kan “Vurdering av antibakterielle overflater på tekstilmaterialer”²⁰ brukes, noe som gir loggreduksjon av det piggete patogenet.

Protocol

1. Fremstilling av nanopartikler Nano-urte innkapslingTilbered 50 ml 1% (v/v) eddiksyre.FORSIKTIG: Iseddik er irriterende, noe som kan forårsake alvorlige hudforbrenninger og øyeskader. Bruk en laboratoriefrakk i full lengde, nitrilhansker og vernebriller, og arbeid under en avtrekkshette. Forbered kitosanoppløsning (1,2% w / v) ved å oppløse 0,6 g kitosanflak (middels molekylvekt) i 50 ml 1% eddiksyre (fremstilt ovenfor). Agiter over natten (O / N) ved romtemperatur…

Representative Results

Innledende screening av de syntetiserte NPeneEtter to-trinns olje-i-vann-emulsjonsteknikk16 ble de bioaktive forbindelsene (karvacrol og tymol) vellykket innkapslet i kitosan. Dette ble bekreftet av UV-Vis-spektrofotometri for maksimal absorpsjon av de respektive bioaktive forbindelsene sammenlignet med kontrollene, som var kitosan NP uten bioaktive forbindelser. De konstituerte NPene var homogene og stabile over 12 måneder ved 4 °C. Den initiale screeningen av antimikrobie…

Discussion

Den antimikrobielle effekten av biocider er konvensjonelt testet ved kvantitative analyser, for eksempel minimum hemmende konsentrasjon (MIC) og minimum bakteriedrepende konsentrasjon (MBC), hvor bakteriene er nedsenket i en antimikrobiell væske i 24 timer. Imidlertid er disse analysene ikke egnet for belagte stoffer, der væskegrensesnittet mangler og biocidene diffunderes sakte langs stofffibrene. Derfor har mange standard stofftester blitt etablert, for eksempel AATCC 147, ISO 20645, AATCC 100 og JIS L 1902. En samme…

Materials

Acetic acid	Millipore Sigma	64-19-7
Antibiotic base agar	BD Difco	DF0270-17-4	Also known as Antibiotic Medium 2
Antibiotic seed agar	BD Difco	DF0263-17-3	Also known as Antibiotic Medium 1
Blood Agar (Nutrient Agar with 5% Sheep Blood)	Donated by CFIA
Bromcresol Purple Lactose Agar	Donated by CFIA
Candida albicans	ATCC The Global Bioresource Center	ATTC 10231
Carvacrol	Millipore Sigma	282197 (CAS# 499-75-2)
Centrifuge  Allergra X-22R Centrifuge	Beckman Coulter	Model # X-22R	Refrigerated. Wait at least 20 min or until the temperature reach the set low value (e.g., 4 °C) as the refrigeration takes time.
Chitosan Medium Molecular Weight (CS)	Millipore Sigma	448877 (CAS # 9012-76-4)
Clamshell Heat Press	Intiva	IM1200
Escherichia coli (E. coli)	ATCC The Global Bioresource Center	ATTC 23725
Incubator	Thermo Scientific	1205M34
Letheen Broth	BD Difco	DF0681-17-7	Used to neutralize antimicrobial effects. Product from different manufacturers may require to add Polysorbate 80, which is already added in Difco product.
Milli Q water	Millipore Sigma	ZR0Q16WW	Deionized water
Mueller-Hinton Agar	BD Difco	DF0252-17-6
Pentasodium tripolyphosphate (TPP)	Millipore Sigma	238503 (CAS# 7758-29-4)
Phospahte Buffered Saline (PBS)	Thermo Scientific	AM9624
Pseudomonas aeruginosa	ATCC The Global Bioresource Center	ATTC 9027
Sabouraud Dextrose Agar	BD Difco	DF0109-17-1
Shaking incubator/ Thermo shaker	VWR	Model# SHKA2000
Staphylococcus aureus	ATCC The Global Bioresource Center	ATTC 6538
Thymol	Millipore Sigma	T0501 (CAS# 89-83-8)
Trypticase Soy Agar	BD Difco	236950
Trypticase Soy Broth	BD Difco	215235
Tween 80	Millipore Sigma	STS0204 (CAS # 9005-65-6)
UV-Vis Spectrophometer	Thermo Scientific	GENESYS 30 (840-277000)